miR?200c在子宮內膜腺癌血清及組織中的表達及臨床意義

于靜 姜愛麗 張小妍 李豐玲 李連芹

濱州醫學院煙臺附屬醫院1病理科，2婦科，3生殖醫學科（山東煙臺264100）

子宮內膜癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，據報道2012年在世界范圍內約有32萬例新發病例［1］。在美國2019年估計有61 880 例子宮內膜癌新發病例，在婦女所有癌癥的新發病例中排名第4位，其中死亡人數達12 160例，發病率持續上升［2］。miRNAs是一組內源性小的非編碼RNA，它們通過轉錄后抑制基因表達或通過結合特定目標基因的3'末端非翻譯區域（3'UTR）來影響多種生物過程［3-4］。最近的研究表明，miRNA 表達在腫瘤發生和發展中起著重要的作用［5-7］，miRNAs 最近受到了越來越多的關注。已有多項研究證實組織中miRNA 表達可作為癌癥診斷或預后的生物標志物［8-10］，研究證實miR?200 家族成員是癌癥重要的miRNAs，認為miR?200家族（包括miR?200a、miR?200b、miR?200c、miR?429、miR?141）是一個潛在的生物標志物，有重要的臨床價值［11-12］。

筆者之前的研究發現，miR?200c 可靶向BMI?1基因抑制子宮內膜癌細胞侵襲和轉移［13］，但目前尚未有關于miR?200c 作為診斷子宮內膜癌的生物標志物的研究。為了解miR?200c 對于診斷子宮內膜腺癌及判斷預后是否具有臨床意義，在之前的細胞研究基礎上，本研究進一步探討miR?200c 在子宮內膜腺癌血清及組織中的表達情況及臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2016年1月至2018年12月濱州醫學院煙臺附屬醫院婦科住院手術治療的子宮內膜腺癌標本及病例資料120 例，年齡45 ～76 歲，平均（55 ± 10.56）歲，同時收集同期在婦科門診因異常子宮出血行診斷性刮宮病理結果為增殖期或萎縮型子宮內膜標本100 例為對照組，年齡（43 ～72）歲，平均（50 ± 15.19）歲。對照組與組患者年齡比較差異無統計學意義。納入研究的患者術前均未經過放療、化療和激素等藥物治療，既往無其他惡性腫瘤病史。對納入研究的子宮內膜腺癌病例根據世界衛生組織（WHO）提供的病理診斷標準及國際婦產科聯盟2009年提供的FIGO 分期進行分期。詳細記錄所有納入研究的患者基本資料及臨床資料。經過濱州醫學院煙臺附屬醫院倫理委員會批準，所有納入研究的患者其本人或家屬均知情同意并簽訂知情同意書后進行。

所有納入研究的對象均于手術前或診刮操作前抽取清晨空腹靜脈血5 mL，離心分離血漿后保存與-80 ℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器RNA 逆轉錄試劑盒和SYBER Green PCR 試劑盒均購自中國大連Takara試劑公司，miR?200c?3p 及U6 引物由中國上海吉瑪有限公司合成。熒光定量PCR 擴增儀iQ5 系統進行RNA 的逆轉錄，Real?time PCR ABI 7500 系統進行實時定量熒光聚合酶反應（定量PCR）。miR?200c?3p 引物序列：上游引物：UAAUACUGCCGGG?UAAUGAUGGA；下游引物：CAUCAUUACCCGGCA?GUAUUAUU。U6 引物序列：上游引物：CTCGCTT?CGGCAGCACA 下游引物：AACGCTTCACGAATTT?GCGT。

1.2.2 總RNA 的提取及qRT?PCR 檢測方法Trizol 試劑裂解組織和血清細胞方法提取總RNA，測量RNA 濃度，濃度在1.8～2.0 最佳。按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA 逆轉錄成cDNA，逆轉錄反應程序條件：25 ℃開始30 min；42 ℃30 min；85 ℃5 min；4 ℃保存，逆轉錄后cDNA-20 ℃保存。按照SYBER Green PCR 試劑盒說明書配制PCR 反應體系10 μL：U6 上、下游引物各0.25 μL，miR?200c?3p上、下游引物各0.25 μL，cDNA 6 μL，無RNA 酶DEPC 水3 μL。定量PCR 擴增反應條件：5 ℃預變性20 s；95 ℃變性10 s；60 ℃變性20 s；70 ℃延伸10 s；4 ℃保存。溶解曲線：95 ℃15 s；60 ℃1 min；95 ℃15 s；60 ℃15 s；共40 個循環。采用相對定量法，以U6 為內參。采用2?ΔΔCt法計算miRNA 相對表達量，其中△Ct=Ct 目的基因?CtU6。

1.3 統計學方法所有數據均采用SPSS 23.0 統計軟件分析。計量資料采用均數± 標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。繪制受試者工作特征曲線（ROC）評價血清及組織中miR?200c 的診斷價值。應用多元Logistic 回歸模型分析miR?200c與子宮內膜腺癌的關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜腺癌和正常對照組患者血清和組織中miR?200c 相對表達量比較RT?PCR 方法檢測miR?200c相對表達量，實驗過程中未出現非特異性擴增、污染或引物二聚體，檢測結果可靠，見圖1。子宮內膜腺癌組織和血清中miR?200c 相對表達量2?ΔΔCt平均值顯著高于正常子宮內膜組織和血清中的表達，比較差異有統計學意義（P< 0.05）。見表1。

2.2 子宮內膜腺癌組織及血清中miR?200c 相對表達量與子宮內膜腺癌臨床病理特征的關系子宮內膜腺癌組織和血清中miR?200c 表達與臨床分期、肌層浸潤深度、是否淋巴結轉移相關（P＜0.05）；miR?200c 在臨床晚期、深肌層浸潤和存在淋巴結轉移的子宮內膜腺癌的組織中表達明顯下降，而在臨床晚期、深肌層浸潤和存在淋巴結轉移的子宮內膜癌患者的血清中表達增高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。子宮內膜腺癌組織和血清中miR?200c 表達與患者年齡和分化程度無相關關系（P> 0.05）。多因素Logistic 回歸分析發現，臨床分期、肌層浸潤、淋巴結轉移均是影響miR?200c 表達的獨立性危險因素。見表2、3。

表1 宮內膜腺癌和正常子宮內膜組織和血清中miR?200c相對表達量的比較Tab.1 Comparison of the relative expression of miR?200c in tissues and serum of endometrial adenocarcinoma and normal endometrial x±s

圖1 miR?200c 擴增曲線（A）和溶解曲線（B）Fig.1 Amplification curve（A）and dissolution curve of miR?200c（B）

2.3 血清和組織中miR?200c 對子宮內膜腺癌的診斷價值血清和組織中miR?200c 診斷子宮內膜腺癌的曲線下面積（AUC）及95%CI分別為0.943（0.916 ～0.970）和0.949（0.924 ～0.973）與對照組（AUC=0.5）比較，差異均有統計學意義（P＜0.001）。miR?200c 診斷子宮內膜腺癌的敏感度較好，血清和組織miR?200c 敏感度分別為：76.5%和77.1%；但特異度差，分別為44.7%和30.73%。見圖2、表4。

表2 血清和組織中miR?200c 相對表達量與子宮內膜腺癌患者臨床病理特征的關系Tab.2 The relationship between the relative expression of miR?200c and the clinicopathologica characteristics in serum and tissues of endometrial adenocarcinoma ±s

表2 血清和組織中miR?200c 相對表達量與子宮內膜腺癌患者臨床病理特征的關系Tab.2 The relationship between the relative expression of miR?200c and the clinicopathologica characteristics in serum and tissues of endometrial adenocarcinoma ±s

臨床與病理特征年齡（歲）≤60＞60分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ分化程度G1/G2 G3肌層浸潤＜50%≥50%淋巴結轉移無 有例數28 92 93 27 85 35 91 29 87 33組織miR?200c 3.43±0.68 3.40±0.77 4.31±0.41 3.15±0.61 3.44±0.71 3.33±0.84 4.08±0.43 3.19±0.70 4.27±0.38 3.08±0.57 t 值0.192 9.393 0.705 6.422 11.01 P 值0.718 0.023 0.132 0.010 0.005血清miR?200c 2.51±0.70 2.36±0.77 2.13±0.61 3.32±0.40 2.43±0.72 2.33±0.84 2.17±0.69 3.11±0.44 2.06±0.56 3.30±0.38 t 值0.869 9.570 0.638 6.855 11.756 P 值0.752 0.014 0.151 0.014 0.003

表3 血清和組織中miR-200c 對子宮內膜腺癌臨床病理特征的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of miR-200c and the clinicopathological features in serum and tissues of endometrial adenocarcinoma

圖2 miR?200c 診斷效能的ROC 曲線Fig.2 ROC curve of miR?200c diagnostic efficacy

表4 血清和組織中miR?200c 對子宮內膜腺癌的診斷價值Tab.4 The diagnostic value of miR?200c in serum and tissues in endometrial adenocarcinoma

3 討論

目前有研究認為腫瘤外泌體的miRNA 表達譜與腫瘤負荷或疾病風險相關，外周血液循環系統或淋巴液攜帶大量的miRNA且分泌具有穩定性［14-16］。

最近有研究報道了血液循環中miRNAs 作為生物學標志物診斷卵巢癌和評價預后的臨床相關性研究，認為miR?200c 是鑒別診斷卵巢腫瘤最敏感、最有特異性的標志物，甚至優于血清CA?125［12］。目前尚未有關于miR?200c 在子宮內膜腺癌中診斷價值的研究。

在之前的研究中筆者發現miR?200c靶向BMI?1基因抑制子宮內膜癌細胞侵襲和轉移，因此推斷miR?200c 可能是判斷子宮內膜腺癌的臨床預后的分子標志物。本研究通過檢測正常子宮內膜和子宮內膜腺癌患者血清及組織中miR?200c 的表達，結果顯示子宮內膜腺癌血清和組織中的miR?200c表達明顯高于正常對照組。miR?200c在臨床晚期、深肌層浸潤和存在淋巴結轉移的子宮內膜腺癌的組織中表達明顯下降，而在臨床晚期、深肌層浸潤和存在淋巴結轉移的子宮內膜腺癌患者的血清中表達增高。此項研究結果與WILCZYNSKI等［17］的一致，這表明miR?200c 可能是一個潛在的預后因素，可區分早期和晚期子宮內膜腺癌。Meta 分析數據表明，子宮內膜實體瘤組織中miR?200c 表達的缺失和血清中miR?200c 的升高與患者生存質量下降呈正相關［18］。本研究中miR?200c 在子宮內膜腺癌臨床晚期和發生轉移的組織和血清中的表達情況與Meta 分析的數據相同，也預示著預后不良。

miR?200c在癌癥中的診斷價值目前已有報道。KIM 等［12］研究發現miR?145 和miR?200c 的上調表達是鑒別診斷卵巢腫瘤最敏感和特異性的標志物，表現優于CA125。有研究報道前列腺癌患者血清中miR?200c 表達的敏感度為67%，特異度為75%［19］。本研究中miR?200c 在子宮內膜癌患者血清中表達的敏感度高于報道中前列腺癌患者血清中的水平，特異度低于報道中前列腺癌患者血清中的水平。 Meta 分析研究發現，每項研究的樣本量、miR?200c 的檢測方法、樣本類型和患者種族不同，檢測血清中miR?200c 表達也有所不同，在胃癌患者血清中miR?200c 表達的敏感度范圍為54.5%～97.0%，特異度范圍為45.0%～100.0%［20］，因此在同種類型的癌癥患者血清中miR?200c 表達的敏感度和特異度范圍比較大。本研究發現miR?200c 在子宮內膜腺癌血清中的敏感度為76.5%、特異度為44.7%，敏感度在胃癌患者血清中的表達范圍內，特異度低于胃癌患者血清中的范圍。關于miR?200c在子宮內膜腺癌患者血清中的表達情況尚未有其他報道，無法對比分析。目前還不清楚是否有其他因素如體內雌激素水平影響正常子宮內膜或子宮內膜腺癌組織中miRNA的表達水平。KANGAS等［21］研究發現循環體外miR 家族可以作為代謝和炎癥狀態的指標，受更年期激素變化的影響。因此我們推斷在本研究中miR?200c 診斷子宮內膜腺癌的敏感度可能受到了體內雌激素水平的影響。miR?200c 在乳腺癌［22］、肺癌［23］、卵巢癌［24］、結腸癌［25］等惡性腫瘤中均表達上調，因此筆者推斷miR?200c在多種惡性腫瘤中表達上調，作為診斷子宮內膜腺癌的分子標志物特異性差。

綜上所述，已有研究證實miR?200c是診斷惡性腫瘤的分子標志物，但本研究認為雖然血清miR?200c診斷子宮內膜腺癌敏感度較高但特異度較低，miR?200c 作為診斷子宮內膜腺癌的分子標志物證據不足。本研究在實驗方法、樣本量較小等方面尚有很多不足之處，尚需更深入的研究來進一步完善miR?200c作為子宮內膜腺癌的診療評估體系。