基于基因拷貝數的缺失型α地中海貧血檢測體系研究

呂姍 王太重 覃茜 李佳 陳發欽

1右江民族醫學院附屬醫院婦產科（廣西百色533000）；2右江民族醫學院醫學檢驗學院（廣西百色533000）；3百色市婦幼保健院遺傳實驗室（廣西百色533000）；4右江民族醫學院（廣西百色533000）

地中海貧血（簡稱地貧）已成為世界上影響人群最大的單基因遺傳病［1］。在地中海地區、中東及東南亞多見，而在我國，主要分布在廣東和廣西地區［2］。最新的調查顯示，廣西地貧的基因攜帶率為21%（α地貧15.2%，β地貧5.8%）［3］。臨床上α地貧的嚴重程度與α基因缺陷的數量有關［4］。重型地貧目前尚無有效治療方法，產前篩查和地貧基因檢測是優生優育的有效措施［5?6］。雖然自2010年開始，廣西壯族自治區人民政府啟動實施了《廣西壯族自治地中海貧血防治計劃》，大規模推廣地貧的產前診斷，廣西中、重型地貧患兒的出生率開始明顯下降，但據不完全統計，當前中、重型地貧患者至少有90 000 多例，合計發病率仍高達0.2%。曾慶青［3］研究發現，在調查的300 多例重型地貧患兒中，多于30%是2010年后出生的，說明當前實行的地貧篩查方案存在不足，不利于優生優育。跨越斷裂點PCR（Gap?PCR）和實時熒光定量PCR（real time PCR）技術是缺失型α地貧常用的篩查技術，但Gap?PCR 無法檢測未知的基因型。因此，研究設計一個高通量高靈敏度的、能檢測非常見基因型的方法，有利于廣西開展大規模缺失型α地貧基因突變的分子流行病學篩查，以便及早發現攜帶者，及早采取防控措施，降低廣西人群地貧的基因攜帶率和患病率有重要意義。自1991年開始，研究者連續報道，在廣西境內和廣西的近鄰廣東，檢測出“罕見的”缺失α地貧基因突變的基因型［7?11］。本研究建立基于α珠蛋白基因拷貝數變化的缺失型α地中海貧血基因突變的高通量檢測體系——三重TaqMan 實時熒光定量PCR，通過檢測α1、α2、ζ 的基因拷貝數的變化，可以發現上述基因的缺失，實現非常見缺失型α地貧基因型和基因頻率的探索，可以有效地在產前進行地貧基因缺陷的診斷，促進優生優育的開展。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集收集2018年8月至2019年7月，在百色市婦幼保健院和右江民族醫學院附屬醫院進行地貧篩查的外周血標本共169 例，其中69 例為已知α地貧基因型標本，100 例為臨床待測標本。所選標本年齡≥18 歲，EDTA 抗凝，4 ℃保存不超過7 d。樣本收集時均得到受檢者的知情同意，可用于后續進一步實驗研究。

1.2 主要儀器與試劑ABI7500 熒光定量PCR 儀（新加坡Thermo Flisher 公司）；TAKARA HS Taq 酶，10 × PCR Buffer 購自大連寶生物公司；25 mmol/L氯化鎂購自珠海寶銳生物有限公司；dNTPs 購自深圳菲鵬生物技術有限公司；無核酶水購自Life公司；組織DNA 提取試劑盒購自深圳優圣康生物科技有限公司；缺失型α地中海貧血基因Gap?PCR診斷試劑盒購自深圳益生堂公司。

1.3 基因組DNA 提取基因組DNA 提取與純化使用深圳優圣康生物科技有限公司生產的組織DNA 提取試劑盒，參照試劑說明書進行。

1.4 引物及探針設計引物及探針的設計參照ZHOU 等［12］的方法，NCBI 下載相關序列后，使用ABI 的Primer Express 軟件輔助設計。引物探針的核酸序列見表1。HBA、CRE、HBZ 探針的5'端分別標記有熒光報告基團FAM、JOE、CY5；HBA、CRE 的3'端均標記有熒光淬滅基團BHQ1，HBZ 的3'端標記有熒光淬滅基團BHQ3。符合多重Taq?Man 熒光定量PCR 體系要求［13］。引物和探針均由深圳優圣康生物科技有限公司合成。

表1 設計的引物探針核酸序列Tab.1 The designed primers probe nucleic acid sequence

1.5 三重TaqMan 熒光PCR 體系優化參考LIVAK 等［14］和ZHOU 等［12］報道的方法，建立三重TaqMan 熒光PCR 體系并對體系中的緩沖液、引物、探針、鎂離子、dNTPs 等成分的濃度進行優化。此體系含主反應液16.5 μL、引物探針Mix 3 μL、Takara DNA 聚合酶0.5 μL、DNA 模板5 μL，反應體系總體積25 μL，引物終濃度400 nmol/L，探針終濃度200 nmol/L。反應程序：95 ℃，5 min；45×（95 ℃，10 s；60 ℃，45 s）。

1.6 數據分析及基因缺失判斷見圖1。α珠蛋白基因簇位于16 號染色體的短臂（16p13.3），基因大小約為26 kb［15］。每條染色體包含3 個有功能的基因：1 個ζ（或稱HBZ）、1 個α2（或稱HBA2）和1 個α1（或稱HBA1）。每對染色體共有2 個ζ基因，4 個α基因。因此，正常人有2 個ζ基因，4 個α基因。而人類基因組中的某些看家基因（house keeping genes，HKGs），如ρ?actin、GAPDH、CREBPP，無論在什么情況下都是2 個拷貝。根據缺失型α地貧分子機制中α 珠蛋白基因和看家基因的拷貝數比例差異，以及2?△△ct相對定量分析方法的原理［12］，各缺失的基因型與拷貝數有如下數值規律：正常個體HBZ、HKGs 基因都是2 個拷貝，HBA 為4個拷貝。定量檢測時，△ct=ct目的基因-ct參比基因，△△ct=△ct檢測標本-△ct正常對照，目的基因2?△△ct值即為目的基因與參比基因的比例，計算受檢標本的2?△△ct值，根據2?△△ct值直接分析基因的相對拷貝數，判斷基因的缺失，實現缺失型α地貧的快速篩查。

圖1 HBA1、HBA2、HBZ 在各種已知缺失型α 珠蛋白基因突變時的缺失表現Fig.1 The deletions of HBA1，HBA2 and HBZ in various known deletions of alpha globin gene mutations

1.7 2?△△ct值的確立對69 例已知基因型標本的相對拷貝數定量檢測，根據不同HBA 基因拷貝數分組，確定不同拷貝數的2?△△ct取值范圍，采用均數±標準差表示。不同組間差異的比較用方差分析，以P<0.05 為差異有統計學意義。判定方法見表2。HBA 基因拷貝數的測定：判定值2?△△ct＝1，表示樣本HBZ 拷貝數正常，偏差小于0.1 有較好的分辨率，即陽性值為0 ～0.89（2 個平行結果均值），陰性值為0.9 ～1.1（2 個平行結果均值）。判定值介于0.85 ～0.9、0.6 ～0.65 及0.35 ～0.4 之間即為灰度區，需重新檢測或用Gap?PCR + MLPA 檢測驗證。HBZ 基因拷貝數的測定：判定值2?△△ct＝1，表示樣本HBZ 拷貝數正常，偏差小于0.2 有較好的分辨率（判定原理如HBA 拷貝數的判定）；判定值均值< 0.5，表示拷貝數低于正常。

表2 69 例樣本中不同HBA 基因拷貝數及其判定值2-△△ctTab.2 The copy numbers of different HBA genes and their decision value 2-△△ct in 69 samples ±s

表2 69 例樣本中不同HBA 基因拷貝數及其判定值2-△△ctTab.2 The copy numbers of different HBA genes and their decision value 2-△△ct in 69 samples ±s

HBA 基因拷貝數4 3 2 1例數27 15 19 8 2-△△ct均值1±0.1 0.75±0.1 0.5±0.1 0.25±0.1 2-△△ct 0.9 ～1.1 0.65 ～0.85 0.4 ～0.6 0.15 ～0.35

1.8 診斷性能評價用本實驗研究建立的方法與地貧臨床常規篩查方法進行對比，用Gap?PCR +MLPA 技術進行確認。將100 例臨床樣本按頻數資料數據整理為四格表，計算敏感度和特異度。根據表3 的數據，敏感度計算方法為本方法檢測及Gap?PCR + MLPA 試驗檢測均陽性的個數/Gap?PCR+MLPA 檢測的陽性數；特異度計算方法為本方法檢測及Gap?PCR + MLPA 試驗檢測均陰性的個數/Gap?PCR+MLPA 檢測的陰性數。

2 結果

2.1 臨床地貧樣本的不同基因拷貝數及基因型頻率對100 例臨床樣本，分別用本實驗研究建立的方法和地貧臨床常規篩查方法進行檢測，Gap?PCR + MLPA 技術驗證。其中，檢測出兩個2 基因拷貝的樣本，用普通臨床試劑盒檢測結果為正常4拷貝，通過Gap?PCR + MLPA 驗證后，證明這兩個樣本是異常泰國型樣本，α基因拷貝為2。檢測結果見表3。

表3 100 例臨床標本檢測結果Tab.3 Test results of 100 clinical specimens

2.2 不同統計結果對比結果顯示，本研究建立的方法敏感度和特異度均為100%；臨床常規檢測方法的特異度為100%，敏感度為96%。本研究建立的方法敏感度高于臨床常規檢測方法，檢測準確，并能發現臨床常規檢測不能發現的非常見地貧基因型，如泰國基因型。

3 討論

地貧是一種由于珠蛋白肽鏈合成速率降低導致珠蛋白肽鏈合成不平衡的血紅蛋白病［16?18］，臨床表現為溶血性貧血癥狀。孕婦經過遺傳咨詢和產前診斷后，可為預防重癥地貧患兒提供重要理論依據［19］，產前地貧篩查和地貧基因檢測是廣東和廣西地區當前優生優育的重要措施［20］。

本實驗建立的檢測方法不同于目前臨床所用的檢測方法，目前臨床對于缺失型α地貧的檢測所用的試劑盒只能常規檢測幾種常見類型的α地貧，如-SEA、?α4.2和?α3.7［21］，不能檢出靜止型α地貧，也不能檢出非常見的α地貧，且操作繁瑣。本研究建立起了基于α珠蛋白基因拷貝數變化的高通量高靈敏篩查方法，采用相對定量技術及2?△△ct原理，相對定量α地貧基因拷貝數，從而檢測α基因缺失或基因疊加，操作簡單可行。同時，由于HBA2 和HBA1 具有高度的同源性，作為一個初篩試驗，測定HBA2 和HBA1 是不必要的。因此，本研究僅測定HBA2 和HBA1 的共同特征基因片段HBA。HBZ 基因雖然在成人是關閉的，但如果患兒的2 個HBZ 基因都缺失，將在胚胎期死亡，形成流產，從而增加社會醫療成本。以前的篩查方法，都僅檢測HBA2 和HBA1，而忽略HBZ，因而沒有關于單純HBZ 缺失的報道。本研究設計的新的三重TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測體系加入了對HBZ 基因的檢測，或許會檢出由HBZ 基因缺失所致的非常見缺失型α地貧。

DNA 的提取是本實驗的關鍵步驟，經比較快速提取法（不分離細胞）、紅細胞裂解液分離白細胞、細胞裂解液分離白細胞核、細胞分離液分離白細胞四種方法，若不分離白細胞，直接提取DNA，結果對HBA 及HBZ 的擴增影響非常顯著，不符合本實驗方法標準。因此，本研究最終選擇將所取的臨床外周血標本先用白細胞分離液分離白細胞作為前處理，以確保得到最高濃度的DNA。同時，實驗結果顯示，DNA 提取過程中，95 ℃處理1 h 的步驟不可或缺，對結果有較大影響。

本研究基于α珠蛋白基因拷貝數變化建立的α地貧篩查方法，能夠檢測常見的和非常見的缺失型α地貧基因突變，其檢出效率和準確性較高，敏感度和特異度均為100%，臨床常規檢測方法的敏感度只有96%。經驗證，本研究建立的檢測體系能夠檢測臨床常規檢驗方法未檢出的非常見型α地貧基因型泰國型（??THAI）。

另外中國南方地區有一定比例的HKαα等位基因，血液學表現較輕，臨床診斷困難［22］，某些情況下可能導致HKαα等位基因被誤診為?α3.7/αα。目前仍待進一步探索，力求為HKαα基因型與?α3.7/αα的鑒別診斷提供更多基因診斷咨詢，同時探索出更多非常見缺失型α地貧基因型檢測手段。