（1，3）-β-D葡聚糖檢測聯合其他微生物學檢測在侵襲性真菌病診斷中的相關性分析

楊金，朱均昊，李莉，章強強

侵襲性真菌病（invasive fungal disease，IFD），是指真菌侵入人體組織、血液，并在其中生長繁殖導致組織損害、器官功能障礙和炎性反應的病理和病理生理改變。隨著廣譜抗菌藥物、

皮質類固醇激素及免疫抑制劑在臨床上的廣泛應用，IFD發病率呈明顯上升趨勢。對IFD的早期高效診斷有利于改善疾病的轉歸。傳統的真菌感染檢測方法主要有真菌形態學、病理學、分子生物學、免疫學等，但這些方法本身具有各自的局限性，檢測耗時久、靈敏度低等并易造成漏診，常無法滿足臨床早期診斷要求。近年來，真菌血清學檢查（1，3）-β-D葡聚糖檢測（G試驗）以其無創、快捷、靈敏等優勢在真菌早期診斷中發揮重要作用。本研究對復旦大學附屬華山醫院高度懷疑IFD患者的血清標本作G試驗檢測，以患者臨床診斷結果為依據，并與傳統真菌涂片、培養方法及隱球菌莢膜抗原檢測結果加以比較，探究G試驗聯合真菌涂片、真菌培養及隱球菌莢膜抗原檢測等微生物學檢測在IFD診斷中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例來源

收集2018年2－12月我院普外科、胸外科、泌尿外科、感染科、血液科、腎內科、神經內科、呼吸科等8個科室高度懷疑IFD住院患者，住院期間進行G試驗，以及血液、無菌體液、組織置換液和合格痰標本進行真菌涂片、真菌培養。

1.2 IFD判定

本研究以歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協作組和美國國立變態反應和感染病研究院真菌病研究組（EORTC/MSG）共識組于2008年修訂并發表的IFD定義的國際共識為診斷標準[1-2]，將診斷結果分為：確診、擬診和疑似。本研究采用回顧性研究方法，查閱病史，綜合分析患者臨床癥狀和體征、影像學及微生物學檢測結果、藥物使用情況及療效，作出相應診斷結果。診斷結果以確診或擬診IFD為真陽性，非IFD為真陰性。

1.3 研究方法

1.3.1 G試驗采用IGL 800全自動真菌/細菌動態檢測儀和天津喜諾生物有限公司（GC180424）真菌G試驗試劑盒，進行動態光度法檢測。

1.3.2 真菌學檢查包括真菌涂片和真菌培養及鑒定。標本為合格痰、支氣管肺泡灌洗液、血、腦脊液、腹水和組織置換液。痰真菌培養陽性病例需同時符合真菌涂片陽性方納入統計。采用科瑪嘉沙保弱葡萄糖瓊脂培養基、科瑪嘉念珠菌顯色培養基、API20C AUX及ID32C或基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術（MALDI-TOF MS）（江蘇天瑞儀器公司）進行分離、鑒定。

1.3.3 隱球菌莢膜抗原檢測采用美國Immuno-Mycologics公司生產的隱球菌莢膜抗原試劑盒，對樣本進行隱球菌莢膜抗原定量和定性檢測。

1.4 統計分析

檢測結果以確診或擬診IFD為真陽性，非IFD為真陰性。采用SPSS 17.0軟件，組間計量資料比較用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義，進行統計學分析。計算單項檢測方法和聯合檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值。

2 結果

2.1 病例分布

選取在2018年2－12月我院上述8個科室住院期間同時進行G試驗、真菌涂片和真菌培養的患者共942例，其中184例另行隱球菌莢膜抗原檢測。按病原菌進行區分：侵襲性念珠菌病確診62例，疑似127例；侵襲性曲霉病確診11例，擬診33例，疑似27例；侵襲性隱球菌病確診35例；地方性真菌病確診7例，其中確診馬爾尼菲籃狀菌病5 例，莢膜組織胞漿菌病和著色真菌病各1例。非感染640例。

2.2 G試驗檢測結果

G試驗結果以100 ng/L為陽性臨界值。以確診或擬診IFD為真陽性（隱球菌除外），非IFD診斷為真陰性。942例患者中，除去疑似IFD 154例及確診侵襲性隱球菌病35例，余下753例中，G試驗陽性334，陰性419例。G試驗與臨床診斷比較見表 1。四格表分析，G試驗靈敏度為92.9%，特異度為59.0%；陽性預測值和陰性預測值分別為31.4%和98.1%。見表2。

2.3 涂片、培養等真菌學檢測結果

在上述的753例中，真菌涂片陽性87例，陰性666例；真菌培養陽性133例，其中真陽性88例。真菌學檢查與臨床診斷比較見表1，真菌學檢查靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值見表2，真菌培養結果及相應G試驗陽性結果見表3。

2.4 聯合檢測結果

將G試驗、真菌涂片及真菌培養三項試驗聯合進行檢測，三項中至少有兩項結果陽性則為聯合檢測陽性，余為聯合檢測陰性。聯合檢測結果與臨床診斷的比較見表1，聯合檢測靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值見表2。

表1 G 試驗和真菌學檢查及聯合檢測結果Table 1 Results of G-test，mycological examinations and combined panel test

表2不同檢測方法用于診斷IFD時靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值比較Table 2 Sensitivity，specifcity，positive predictive value and negative predictive value compared between different laboratory assays in diagnosis of invasive fungal diseases（%）

表3真菌培養真陽性菌種分布情況及相應G 試驗陽性株數Table 3 Distribution of fungal species by specimen type and the corresponding positive number detected by G-test

2.5 G試驗與隱球菌莢膜抗原檢測

在184例進行隱球菌莢膜抗原檢測標本中，35例確診隱球菌病，隱球菌莢膜抗原檢測均為陽性（定量滴度從1∶10～1∶1 256）；其余診斷為非IFD，隱球菌莢膜抗原檢測均為陰性。35例隱球菌病中，G試驗陽性27例；149例非隱球菌病中，G試驗陰性121例。G試驗對隱球菌病靈敏度為77.1%，特異度為81.2%；陽性預測值為49.1%，陰性預測值為93.8%。

3 討論

隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑和各種導管插管等治療手段應用及造血干細胞和實體器官移植的開展，自身免疫性疾病、艾滋病、惡性腫瘤及糖尿病等基礎疾病發病率的增加以及人口老齡化等因素，IFD發病率和死亡率逐年升高。同時，近年來發現IFD不僅在免疫缺陷患者中常見，在免疫正常患者如慢性阻塞性肺疾病患者中發病率也出現上升[3]。

（1，3）-β-D葡聚糖是一種廣泛存在于真菌細胞壁中的多糖成分（接合菌和隱球菌除外）[4]，可通過特異性激活鱟變形細胞裂解物中的G因子，激發凝血級聯反應，形成凝固蛋白后利用比色法或比濁法進行定量檢測，故命名為G試驗[5]。侵襲性真菌感染時真菌被吞噬處理后，持續釋放（1，3）-β-D葡聚糖，此時檢測血液或體液中（1，3）-β-D葡聚糖抗原含量會顯著增高[6]。淺部真菌感染或定植時，（1，3）-β-D葡聚糖未被釋放，故其血清檢測為陰性。研究提示（1，3）-β-D葡聚糖對侵襲性真菌感染診斷有重要價值[7]，并且憑其方便快捷、耗時短的優勢，在深部真菌感染早期診斷中起著重要作 用。

本研究結果顯示，對于除隱球菌感染外的其他IFD，G試驗靈敏度為92.9%，顯著高于直接涂片和真菌培養；特異度為59.0%，明顯低于真菌學檢測方法；G試驗陽性預測值為31.4%，陰性預測值較好，為98.1%。以上數據均與文獻報道一致[8]。G試驗陽性預測值較差，存在假陽性的因素常見于使用葡聚糖的靜脈制劑或紗布等醫用材料，使用纖維素膜進行透析，服用多糖類抗腫瘤藥物、菌菇類食物或輸注免疫球蛋白等血液制品，鏈球菌菌血癥，標本脂血，黃疸及污染等[9-10]。G試驗陽性結果對于IFD雖然不具特異性，但能夠提示侵襲性真菌感染的可能性。而造成G試驗假陰性可能與以下原因有關：①患者存在吞噬細胞功能缺陷，如粒細胞缺乏癥等，真菌進入血液但是沒有被吞噬細胞處理，（1，3）-β-D葡聚糖未被釋放出來或釋放很少；②血液中（1，3）-β-D葡聚糖被免疫系統清除或自然降解；③（1，3）-β-D葡聚糖可能與相應抗體形成免疫復合物，而不能被檢出；④標本室溫放置時間過長或凍存后標本中（1，3）-β-D葡聚糖自然降解；⑤臨床上為了減少IFD發病率，在診斷之初預防性使用某些抗真菌藥物，抑制（1，3）-β-D葡聚糖釋放；⑥局灶性曲霉病及近平滑念珠菌引起的侵襲性感染G試驗靈敏度較低或呈陰性結果。本研究中，真菌直接涂片法特異度較高，且直接涂片法可為臨床提供最為直接的診斷依據，具有檢測快速的優勢，但其靈敏度較低，標本質量及檢驗人員的技術水平直接影響檢驗結果。而真菌培養作為診斷深部真菌感染的重要方法，能對培養出的真菌進行鑒定和藥敏試驗，為臨床合理使用抗真菌藥物提供有效證據，但培養周期較長，具有滯后性[11]，陽性預測值也較低，亦無法滿足臨床需求。

早期診斷對于侵襲性真菌感染治療成敗起著重要作用。將G試驗、真菌涂片鏡檢與真菌培養聯合檢測一定程度上彌補了單獨檢測的各自不足。本實驗中，聯合檢測診斷IFD靈敏度可達97.3%；陰性預測值達99.5%，即當三種檢測方法檢驗結果均為陰性時，提示患者感染IFD的可能性非常小，有助于排除IFD診斷，降低漏診率和誤診率。聯合檢測的特異度及陽性預測值較單獨G試驗對應指標也有很大提高，對于指導臨床盡早抗真菌治療更有說服力。因此，臨床上將三種方法聯合使用，既可具有G試驗簡便、快速、靈敏度高的優點，又具有直接涂片法及真菌培養法能區分真菌種屬的優勢，為臨床提供直接診斷依據。

對于隱球菌病檢測常采用隱球菌莢膜抗原檢測，該法簡便、快速，能有效診斷隱球菌感染，且具有良好的靈敏度和特異度，雖然本試驗中隱球菌莢膜抗原檢測靈敏度和特異度均達到100%，但在臨床使用中不可避免存在假陽性和假陰性。一方面，系統性紅斑狼瘡、結節病、類風濕因子、抗酸桿菌均與新型隱球菌莢膜多糖抗原存在交叉抗原，引起假陽性；另一方面，高水平隱球菌抗原所致的鉤帶現象和體內未知非特異性蛋白對隱球菌抗原的掩蓋效應，可引起假陰性[12]。傳統觀點認為隱球菌細胞壁外莢膜致使（1，3）-β-D葡聚糖難以釋放，因此G試驗通常不適用于隱球菌檢測。但根據本研究結果，G試驗診斷隱球菌感染靈敏度達到77.1%，說明部分隱球菌感染患者血清（1，3）-β-D葡聚糖也有升高并能被G試驗檢測出；同時本試驗中G試驗對隱球菌病陰性預測值較好，這與以往結論出現偏差，一方面可能為本實驗標本數量采集有限所致，另一方面隱球菌感染可能與（1，3）-β-D葡聚糖釋放仍存在一定聯系。

綜上所述，G試驗雖然無創快捷，有助于臨床早期快速判斷，但結果受干擾因素較多，影響其特異度及陽性預測值；真菌涂片方便簡單，但陽性檢出率取決于標本的采集與質量，以及檢驗人員的技術水平；真菌培養可以確定感染的菌種，有助于抗真菌藥物的選擇，合格標本培養陽性具有重要意義。隱球菌莢膜抗原檢測雖然靈敏度、特異度均良好，但仍會存在少量假陽性的弊端。臨床將G試驗與真菌學檢測方法聯合使用，揚長避短，能為臨床及時準確診斷提供有力支撐，提高患者治愈率和生存率。