圍產期李斯特菌感染6例的臨床及分子特征

賈忠蘭，葉長蕓，許麗風，王怡倩

李斯特菌為革蘭陽性短桿菌，其中產單核細 胞李斯特菌（Listeri a monocytogenes）和伊氏李斯特菌（Li steria ivanovi i）具有致病性，能夠引起人類和動物李斯特菌感染。作為重要的食源性致病菌，產單核細胞李斯特菌在全球范圍內得到廣泛關注和深入研究。李斯特菌感染的發病率較其他食源性疾病低，但其病死率高[1]。產單核細胞李斯特菌可穿過宿主的腸道屏障、血腦屏障、胎盤屏障，引起血流感染、中樞神經系統感染和局灶感染。該菌的清除依賴于細胞免疫，孕婦由于妊娠期激素水平升高導致細胞免疫水平下降，是主要的易感人群之一[2-3]。孕婦感染李斯特菌可導致流產、早產、胎死宮內等不良后果；通過母嬰感染的新生兒可引發血流感染、腦膜炎甚至死亡。國內以李斯特菌感染散發病例報道為主[4-5]，病原菌的分子流行病學特征分析較少。

根據基因序列分型、菌體抗原和鞭毛抗原，產單核細胞李斯特菌可分為4個家系、12個血清型：家系Ⅰ（1/2b、3b、7、4b、4d和4e）、家系Ⅱ（1/2a、3a、1/2c和3c）、家系Ⅲ和Ⅳ（4a和4c）。家系Ⅰ菌株與暴發或者散發的李斯特菌感染具有相關性，家系Ⅱ菌株多從食品或者相關環境中分離，家系Ⅲ和Ⅳ菌株常分離自反芻動物。1/2a、1/2b和4b血清型菌株是引起李斯特菌感染的常見菌型[6]，占臨床李斯特菌感染病例分離株的95%以上[7]。另外，李斯特菌感染的致病性與其毒力基因密切相關，具有毒力基因hl y（溶血素）、i nl A（內化素A）、actA（肌動蛋白）、pl c B（磷脂酶C）和prfA（PrfA蛋白）的李斯特菌可通過血腦屏障和胎盤屏障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例定義圍產期李斯特菌感染病例定義為患者在圍產期具有產單核細胞李斯特菌感染的臨床癥狀，從患者的臨床標本中能夠分離到產單核細胞李斯特菌[8]。

1.1.2 菌株來源2012年1月－2017年12月從北京市海淀區婦幼保健院臨床標本中分離的菌株，標本類型涉及孕產婦的宮腔拭子、胎盤拭子和羊水，新生兒的咽拭子、皮膚拭子、耳拭子、血液、腦脊液和糞便。

1.2 方法

1.2.1 血清學分型通過多重PCR對菌株進行血清學分類[9]，并采用日本Denka Seiken公司的血清抗體試劑盒按照說明書進行血清型鑒定。

1.2.2 脈沖場凝膠電泳（PFGE）分析按照美國CDC PulseNet的標準操作程序，選用限制性核酸內切酶Asc I和A paI酶對細菌基因組進行酶切，PFGE圖像用BioNumerics（Version 5.0）軟件進行比對和聚類分析。

1.2.3 多位點序列分型（MLST）參照法國巴斯德研究所的產單核細胞李斯特菌MLST數據庫（http://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html）操作流程，對7個管家基因（abcZ、b lgA、cat、dapE、d a t、l d h、l h k A）PCR擴增片段進行測序和序列比對分析，獲得菌株的序列型（sequence type，ST）。

1.2.4 毒力基因檢測根據參考文獻 [7]合成引物，對分離菌株進行6個毒力基因（pl c B、act A、hly、iap、prfA、inlA）的檢測。

2 結果

2.1 臨床特征

2012年1月－2017年12月本院6例產單核細胞李斯特菌感染病例（孕婦及其胎兒/新生兒定義為1個病例），孕婦年齡28～35歲，孕周為29～39周，2例患妊娠糖尿病，其他4例孕早期孕檢正常。孕婦病程為1～3 d，臨床表現為發熱、腹痛、胎心胎動異常。4例新生兒均為早發型感染（≤7 d），3例新生兒為早產兒，4例出現胃腸炎、血流感染和腦膜炎等感染癥狀，1例出生后2 d治療無效死亡；2例胎死宮內。胎盤病理有不同程度的炎癥表現，主要表現為絨毛膜板下及絨毛膜炎癥、大量中性粒細胞浸潤，其表現符合急性胎膜絨毛膜炎。

孕產婦初始經驗性抗菌藥物治療選用頭孢呋辛等，明確病原菌為產單核細胞李斯特菌后，調整為青霉素、氨芐西林、美羅培南、左氧氟沙星等治療，6例孕婦產后抗菌藥物治療后預后良好。胎兒/新生兒預后不良，3例胎兒/新生兒死亡，3例新生兒經抗菌藥物治療后痊愈出院。見表1。

2.2 產單核細胞李斯特菌的分子特征分析

6株產單核細胞李斯特菌分為3種血清型，4b型為主（4株）、1/2a型和1/2b型各1株。MLST結果以ST2為主（3株），ST1、ST5和ST91各1株。通過使用A s c I和A p a I酶的PFGE分析，6株產單核細胞李斯特菌分為5種PT型，其中LM2870和LM2872為相同型別。6株分離菌均檢測到毒力基因（plcB、actA、hly、iap、prfA、inlA）。見圖1。

3 討論

產單核細胞李斯特菌是一種重要的食源性致病菌，人或動物食用其污染的食品后會引發嚴重的疾病，受國內外食品安全和公共衛生相關部門的高度重視。文獻報道顯示，圍產期人群發生李斯特菌感染的風險是非圍產期人群的18倍，16%～27%李斯特菌感染病例為孕婦[10]。2017年1月－2018年5月，南非發生有報道以來最嚴重的李斯特菌感染暴發事件，其中42%病例為孕婦及其新生兒[11]。英國圍產期李斯特菌感染占總侵襲性李斯特菌感染病例的12%[12]，美國占17%[13]，法國占17.7%[14]，以色列占35%[15]。我國李斯特菌感染多以散發病例報道為主。根據文獻綜述，1964－2011年李斯特菌感染中圍產期病例占52%[16]，2011－2016年占64.4%[17]。孕婦感染產單核細胞李斯特菌后多表現為非特異性流感樣癥狀，孕婦產后預后良好，但其胎兒或新生兒感染后果嚴重，甚至死亡。本研究報道的病例孕婦臨床表現為發熱、腹痛和胎心胎動異常等，結束妊娠后經抗菌藥物治療均預后良好。而胎兒/新生兒預后嚴重不良，2例胎死宮內，1 例感染嚴重治療無效死亡，其余3例新生兒均患有不同程度的嚴重感染，包括肺炎、血流感染、腦膜炎。根據國內外報道，妊娠期感染產單核細胞李斯特菌后進行敏感抗菌藥物治療，可以避免不良預后[18-19]。產單核細胞李斯特菌對頭孢菌素天然耐藥，文獻推薦一線抗生素氨芐西林≥6 g/d，二線抗生素紅霉素4 g/ d，靜脈滴注，療程14 d[10]。本研究6例感染孕婦首選抗生素均為頭孢菌素類，明確病原后部分改用青霉素、氨芐西林或左氧氟沙星治療，經治療預后良好。新生兒治療首選抗生素為氨芐西林、頭孢菌素類和美羅培南，明確病原菌后均改用氨芐西林。除2例胎死宮內外，1例癥狀嚴重患兒氨芐西林治療2 d后死亡，另外3例新生兒經過治療痊愈出院。胎兒/新生兒感染的預后嚴重不良，本組6例中3例胎兒/新生兒死亡。孕晚期或者足月感染的患者根據臨床情況進行剖宮產，及時正確的抗菌藥物治療可以減輕新生兒出生后的感染癥狀，降低新生兒的死亡率。因此，對孕婦進行李斯特菌感染早期診斷和及時治療，對圍產期李斯特菌感染的控制非常重要。

表1 6例圍產期李斯特菌感染母嬰的臨床特征Table 1 Characteristics of 6 cases of maternal-neonatal listeriosis

表1（續）Table 1（continued）

圖1 6株產單核細胞李斯特菌臨床分離株的PFGE 聚類圖Figure 1 PFGE cluster for 6 strains of Listeria monocytogenes isolated from patients

李斯特菌感染主要通過食用被致病菌污染的食品引發，加強食源性李斯特菌感染的流行病學監測非常重要。血清學分型和分子分型是細菌性傳染病分子流行病學調查和監測的重要手段，對李斯特菌感染的追蹤溯源及預防控制具有非常重要的意義。經過血清學分型，6例感染病例中4例為4b型菌株感染，相關病例胎兒/新生兒預后嚴重不良，其他2例為1/2a、1/2b型。根據Elinav等[15]和Girard等[20]報道，妊娠相關李斯特菌感染中4b型菌株感染分別占61%和79.5%。腦膜炎患兒的4b型菌株分離率和感染患者的病死率顯著高于其他血清型[21]。這些結果表明4b型菌株可能具有較強的毒力，易引起嚴重的不良預后。國內文獻報道人源產單核細胞李斯特菌血清型主要為1/2b、1/2a、4b型，但是血清型1/2b、1/2a占比較高[22-23]，與本研究以4b型為主存在差異，可能與本研究所涉及的患病人群不同有關，還可能與本研究病例數較少有關。根據MLST，6株產單核細胞李斯特菌歸為4個ST型，以ST2為主（3株），文獻報道CC1（ST1）和CC2（ST2）克隆群屬于臨床菌株的優勢克隆群[24]，且ST2、ST5和ST91菌株與胎盤感染相關[25]，本研究胎盤感染以ST2菌株為主，與文獻報道一致。本研究中共有5種PT型，其中病例2和病例4分離的菌株具有相同PT型（PT366），發病時間分別為2012年2月和2013年10月，沒有明顯時間聚集性，是否為相同感染來源需結合流行病學調查和當地同期食品菌株數據進一步分析。

我國自2000年起開展食品的產單核細胞李斯特菌監測，食品污染率可高達30%[26]。孕婦對李斯特菌感染的整體知曉率較低[27-28]。問卷調查發現80%的孕婦在懷孕期間食用過高風險食物，因此安全飲食對孕婦非常重要[12]。作為易感人群，孕婦在妊娠期間應避免食用易被污染的高風險食品，同時也需加強食品衛生監管。法國通過加強食品安全監管和孕婦飲食安全的宣教，從1984—2011年妊娠期李斯特菌感染的發病數大幅下降[20]。因此對于高危人群應加強李斯特菌感染相關知識的宣傳，提高孕婦在妊娠期間安全飲食的意識，減少圍產期李斯特菌感染的發生，從而降低新生兒感染率和死亡率。