朱 帥,黃夢玲,樊 俐,楊瑞鵬,張 敏,劉 云
專題報道(一)
富含不飽和脂肪酸蛋黃磷脂酰膽堿的提取與分子結構分析
朱 帥1,黃夢玲1,樊 俐1,楊瑞鵬2,張 敏2,劉 云1
(1. 北京化工大學 生命科學與技術學院,北京 100029;2. 蜜兒樂兒乳業(上海)有限公司,上海 200335)
磷脂酰膽堿(PC)是雞蛋蛋黃中的主要活性因子,為人體提供營養和保護。采用響應面法優化乙醇提取富含不飽和脂肪酸蛋黃PC工藝參數,經薄層色譜初步純化后,氣相-質譜(GC-MS)聯用儀和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF/MS)分析PC脂肪酸組成和分子結構。結果表明,乙醇提取蛋黃PC最適工藝參數為:料液比(v∶v)為1∶16(g/mL),乙醇濃度93.77%,提取溫度42.98 ℃。在此條件下,PC提取率24.38%,純度61.19%。PC中主要脂肪酸為油酸(40.66%)、軟脂酸(16.35%)、亞油酸(13.06%)、硬脂酸(7.27%)和棕櫚油酸(5.19%),以及少量花生四稀酸(0.48%)和二十二碳六烯酸(0.37%),共鑒定出9種蛋黃PC分子結構,即16:0/18:0-PC, 16:0/18:1Δ9-PC, 18:0/18:1Δ9-PC, 16:0/18:2Δ9,12-PC, 18:0/18:2Δ9,12-PC, 18:1Δ9/18:2Δ9,12-PC, 16:0/20:4Δ5,8,11,14-PC, 18:0/20:4Δ5,8,11,14- PC和 16:0/22:6Δ3,6,9,12,15,18-PC。
蛋黃磷脂酰膽堿;乙醇提??;脂肪酸組成;分子結構
蛋黃卵磷脂是從雞蛋黃中提取得到的一種天然磷脂混合物,占雞蛋黃干重8%~10%[1-2],主要分為磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI),及少量溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)和鞘磷脂(SM),其中PC含量超過70%[3-5]。研究表明,卵磷脂具有調節血脂[6]、提高記憶力[7]和抗氧化等諸多生理活性[8]。Souza等報道了卵磷脂作為飼料添加劑,可以降低動物膽固醇含量[9],Lesnierowsk 等報道了蛋黃卵磷脂在保健食品領域的應用[10]。此外,卵磷脂還廣泛應用于醫藥和化妝品等行業[11-14]。
目前,卵磷脂提取方法包括有機溶劑萃取 法[15-16]、超聲輔助提取法[17-18]和超臨界萃取 法[19-20]。張椿等采用超聲微波輔助法提取雞蛋卵磷脂,得率為7.5%[2]。范勁松等利用超臨界CO2提取蛋黃卵磷脂,PC得率為17.5%[21]。然而,不同提取方法所得蛋黃PC分子結構種類是不一樣的。陳晉等采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF/MS)與氣相質譜(GC-MS)聯用技術鑒定出9種蛋黃PC分子結構[22],Ali等運用UPLC-Q-TOF/MS鑒定出20種蛋黃PC分子結構[23]。
本文以雞蛋蛋黃粉為原料,采用丙酮脫油、乙醇溶劑提取PC,響應面優化提取工藝參數,所得PC提取物經薄層色譜純化,利用GC-MS和MALDI-TOF/MS分析PC脂肪酸組成和分子結構,為蛋黃卵磷脂產品開發提供技術支撐。
雞蛋:蜜兒樂兒乳業(上海)有限公司;蛋黃磷脂酰膽堿(PC)標準品:上海源葉生物科技有限公司;硅膠板:青島海洋化工廠;丙酮、乙醇均為國產分析純。
FD-1A-50冷凍干燥機:北京博醫康實驗儀器有限公司;DF-101S磁力攪拌器:鞏義市予華儀器有限責任公司;UV-756紫外分光光度計:上海佑科儀器儀表有限公司;RE-52旋轉蒸發儀:上海亞榮生化儀器有限公司;QP2010 Ultra氣相色譜質譜聯用儀:日本島津公司;Autoflex III Smartbeam MAIDI-TOF/MS儀:德國布魯克公司。
1.2.1 工藝流程

圖1 蛋黃卵磷脂提取工藝流程
1.2.2 丙酮脫脂
準確稱取一定質量的干燥蛋黃粉,放入燒杯中,然后加入丙酮,蛋黃粉/丙酮重量體積比(g/mL)為1∶4、1∶7、1∶10、1∶13和1∶16,磁力攪拌進行脫脂處理,脫脂時間為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h。脫脂完成后,抽濾,將濾餅置入恒溫干燥箱中,40 ℃干燥1.5 h,得丙酮不溶物,計算得率。以丙酮不溶物得率大小,考察丙酮脫脂效果。每個實驗點重復3次,取平均值。
1.2.3 乙醇提取PC的單因素實驗
以上述丙酮脫脂后的蛋黃粉為原料,考察了乙醇法提取PC的4個主要影響因素:提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h)、料液比(1∶4、1∶7、1∶10、1∶13和1∶16 g/mL)、乙醇濃度(60%、70%、80%、90%和100%)和提取溫度(20、30、40、50和60 ℃)。每個實驗點均重復3次,取平均值。
1.2.4 乙醇提取PC的響應面優化
單因素實驗結果表明,料液比、乙醇濃度和溫度對乙醇法提取PC效果影響最大。為此,采用響應面Box-Benhken實驗,設計了三因素三水平,以PC提取率為因變量,優化上述3個因素,實驗設計見表1。

表1 響應面實驗因素水平表
1.2.5 分光光度法測定PC含量與PC提取率計算
乙醇提取物中PC含量的測定采用分光光度法進行[17]。首先,配制濃度為10 mg/mL的蛋黃磷脂酰膽堿標準品母液,用乙醇進行適當稀釋。全波長掃描標準品稀釋溶液,PC最大吸收峰為210 nm。然后,以濃度為0、10、20、30、40和50 μg/mL標準溶液,210 nm測定吸光值,以PC濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線(= 0.007 6– 0.001 2,2= 0.997 3)。每一個樣品做3次平行,取平均值。最后,在210 nm條件下測定PC樣品的吸光值,通過標準曲線計算樣品中PC含量,同時,以下公式計算PC提取率:

式中:Y為PC提取率(%);為樣品中PC濃度(μg/mL);V為提取液體積(mL);N為稀釋倍數;M為脫脂蛋黃粉質量(mg)。
1.3.1 薄層色譜純化
將PC提取物和標準品分別用無水乙醇溶解,用毛細管吸取樣液后,點在距薄層板底部1 cm處,待干燥后,將薄層板放入裝有展開劑(氯仿∶甲醇∶水=65∶25∶4,v/v/v)的層析缸中展開,然后用碘蒸氣顯色進行觀察[24]。
1.3.2 GC-MS分析PC脂肪酸組成
甲酯化[25]:準確稱取30 mg樣品放入具塞試管中,加入12%三氟化硼甲醇溶液2 mL,在80 ℃水浴下反應10 min,冷卻后加入0.05 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液2 mL,再在80 ℃水浴下反應 10 min,冷卻后加入5 mL飽和氯化鈉溶液清洗,最后,加入2 mL正己烷溶液提取,吸取上層液,加入少量無水硫酸鈉吸收水分,取上清液過0.22 μm微孔濾膜,裝瓶用于GC-MS分析。
GC-MS分析:色譜柱:DB-5MS UI(Agilent,J&W Scientific,30 m×0.25 mm×0.25 μm),進樣口溫度為250 ℃,分流比為10∶1,載氣為高純氦氣,流速為1 mL/min。升溫程序:100 ℃保持 2 min,以6 ℃/min升至320 ℃保持10 min。離子源溫度為220 ℃,接口溫度為280 ℃,溶劑峰切除時間3 min,掃描范圍:45~500 m/z。
1.3.3 MALDI-TOF/MS分析PC分子結構
將1 μL基質溶液點到板子上揮發干后,再將1 μL待測溶液點到基質上,揮發干溶劑后進行檢測。儀器:配備337 nm氮分子激光器的MAIDI- TOF/MS(BrukerAutoflex III),加速電壓為20 kV,基質為2, 5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB),發射模式為正離子模式,掃描范圍:300~1 000 m/z。
利用Design expert 8.0軟件處理和分析實驗數據。
分別考察蛋黃粉/丙酮料液質量體積比和脫脂時間對脫脂效果的影響,結果見圖2。由圖2a可知,總體趨勢為料液比增大,脫脂效果越好,即丙酮不溶物得率下降。當料液比1∶10時,丙酮不溶物得率為55.49%。進一步加大料液比,丙酮不溶物得率趨于平緩。為此,丙酮脫脂時,料液比選擇為1∶10。由圖2b可以看出,隨著延長脫脂時間,丙酮不溶物得率變化不大,結果表明,脫脂時間對丙酮脫脂效果的影響較小。考慮到1.5 h時脫脂效果較好,最終選擇脫脂時間為1.5 h。
以上述脫脂蛋黃粉為原料,探討乙醇法提取蛋黃PC的工藝技術,分別考察提取時間、料液比(質量體積比)、乙醇濃度和提取溫度對PC得率的影響,結果見圖3。

圖2 丙酮脫脂效果的影響

圖3 乙醇提取脫脂蛋黃粉PC的影響因素分析
由圖3a可知,延長提取時間可適當提升PC產品得率,在1 h時達到最大值16.95%,之后PC提取率略微下降并趨于平緩。這說明乙醇提取1 h,絕大部分PC已經溶解在乙醇中,繼續延長提取時間,PC提取率沒有變化,反而造成時間的浪費,增加提取能耗和成本。因此,提取時間選擇1 h。
由圖3b可以看出,料液比對PC提取率影響較明顯,增大料液比,PC提取率明顯增加。較低料液比(≤1∶6),蛋黃粉與乙醇溶液不能充分混勻,且易使乙醇溶解PC達到飽和狀態,導致PC提取率偏低。提高料液比,蛋黃粉與乙醇溶液接觸充分,PC提取率隨之增加。是當料液比為1∶13,PC提取率逐漸趨于平穩,提取率穩定在15.56%。因此,料液比選取1∶13。
圖3c顯示,乙醇濃度明顯影響PC提取率。乙醇濃度為60%時,PC提取率低(約3%),增加乙醇濃度,PC提取率顯著增加。乙醇濃度為90%時,PC提取率達到最大值22.93%,進一步增加乙醇濃度,PC提取率反而開始下降,原因是乙醇濃度增加,其它醇溶性的雜質也隨之提取出來。因此,乙醇濃度選取90%。
圖3d顯示,提取溫度≤40 ℃時,PC提取率隨提取溫度升高而增加,原因是溫度升高加速了分子運動,可以加速傳質過程。提取溫度為40 ℃時,PC提取率最高,為23.76%。然而,繼續提高提取溫度,PC提取率呈現下降趨勢。原因可能是PC熱敏性所導致,高溫下PC不穩定且易發生氧化作用,致使PC提取率降低。因此,提取溫度選取為40 ℃。
基于單因素實驗結果,根據表1響應面實驗設計,優化乙醇提取PC的主要工藝參數,結果見表2。
使用Design expert 8.0軟件,對表2中的實驗數據進行回歸擬合分析,PC得率()的回歸方程為:
=0.25+0.006 6+0.030+0.013+0.001 7– 0.001 1–0.011–0.0202–0.0382–0.00132
對表2數據進行方差分析和顯著性檢驗,結果見表3。由表3可知,模型校正決定系數2Adj為0.961 1,表明模型預測值有96.11%的可信度。模型確定系數2=0.983 0,說明該模型擬合度好,誤差小。從表3中還可以看出,回歸模型<0.000 1,失擬項值為0.331 2(>0.05),進一步表明模型顯著性極好,偏差小。方差分析結果表明,模型一次項,交互項顯著影響PC提取率(< 0.05);一次項、,二次項2、2和2極顯著影響PC提取率(< 0.01);交互項和不顯著。由值大小可知,各因素對PC提取率的影響作用貢獻大小為:乙醇濃度()>提取溫度()>料液比()。

表2 響應面實驗設計與結果

表3 回歸模型方差分析結果
注:* 表示差異顯著(<0.05);** 表示差異極顯著(<0.01)。
根據響應面等高圖(如圖4)可以直觀地獲得乙醇提取PC的最佳工藝參數:料液比1∶16 (g∶mL),乙醇濃度93.77%,提取溫度42.98 ℃。在此條件下,PC得率預測值為24.38%??紤]實際操作要求,最終確定實驗條件為:料液比1∶16(g∶mL),乙醇濃度94%,提取溫度43 ℃。為驗證該模型的準確性和可重復性,在上述實驗條件下進行3組平行實驗,PC提取率平均為24.23%,與模型預測值相比,相對誤差為0.62%,表明該模型擬合度高,重復性好。

A、B:乙醇濃度和料液比交互作用;C、D:溫度和料液比交互作用;E、F:乙醇濃度和溫度交互作用
2.4.1 薄層色譜分離純化PC
考察3種不同展開劑對PC分離純化的影響,以PC標準品作對照,結果見圖5。由圖5中可知,二氯甲烷/甲醇/水作展開劑,無法有效分離純化PC(如圖5A和B)。展開劑為氯仿∶甲醇∶水= 65∶25∶4(v/v/v),PC和PE可有效分開(如圖5C)。分光光度法測定純化后PC含量,為61.19%,比粗提物PC含量提高近3倍。

A 二氯甲烷∶甲醇∶水=65∶20∶4,v/v/v;B 二氯甲烷∶甲醇∶水=60∶20∶4,v/v/v;C 氯仿∶甲醇∶水=65∶25∶4,v/v/v
2.4.2 GC-MS分析PC脂肪酸組成
分離純化所得PC甲酯化后,進行GC-MS分析,總離子流圖見圖6所示,與標準譜庫對比,得到7種脂肪酸組成,列舉表4中。由此可知,蛋黃PC脂肪酸以不飽和脂肪酸為主,占總脂肪酸58.91%。主要脂肪酸組成為油酸(40.66%)、軟脂酸(16.35%)、亞油酸(13.06%)、硬脂酸(7.27%)和棕櫚油酸(5.19%)。同時,蛋黃PC中還含有少量的花生四稀酸(0.48%)和二十二碳六烯酸(0.37%)。

圖6 GC-MS總離子流色譜圖
2.4.3 MALDI-TOF/MS分析PC分子結構
MALDI-TOF/MS結合GC-MS是分析蛋黃PC分子結構的有效方法[26]。在正離子模式下得到相應的質譜圖,截取m/z為750~850進行分析,結果見圖7。質譜結果表明,從蛋黃中分離的PC具有7種不同類型的脂肪酸和9種分子結構,這和Chen等的研究結果一致[27]。結合GC-MS脂肪酸種類及雙鍵所在位置,9種蛋黃PC的分子結構如圖8所示,即16:0/18:0-PC, 16:0/18:1Δ9-PC, 18:0/ 18:1Δ9-PC, 16:0/18:2Δ9,12-PC, 18:0/18:2Δ9,12-PC, 18:1Δ9/18:2Δ9,12-PC, 16:0/20:4Δ5,8,11,14-PC, 18:0/20:4Δ5,8,11,14-PC和16:0/22:6Δ3,6,9,12,15,18-PC。由此可見,蛋黃PC中含有較高的不飽和脂肪酸,包括棕櫚油酸、亞油酸、油酸、花生四稀酸(ARA)和二十二碳六烯酸(DHA),這些不飽和脂肪酸與人體健康息息相關。

表4 蛋黃PC脂肪酸組成

圖7 MALDI-TOF質譜圖

圖8 蛋黃PC的分子結構
采用丙酮脫脂、乙醇提取的方法提取蛋黃粉中的PC,獲得最佳提取工藝參數:料液比1∶16 (g/mL),乙醇濃度93.77%,提取溫度42.98 ℃。在此條件下,PC提取率為24.23%,與模型預測值(24.38%)相比,相對誤差為0.62%。PC粗提物經薄層色譜分離純化、MALDI-TOF/MS聯用GC-MS分析,得到9種蛋黃PC的分子結構,即16:0/18:0-PC, 16:0/18:1Δ9-PC, 18:0/18:1Δ9-PC, 16:0/ 18:2Δ9,12-PC, 18:0/18:2Δ9,12-PC,18:1Δ9/18:2Δ9,12-PC, 16:0/20:4Δ5,8,11,14-PC, 18:0/20:4Δ5,8,11,14-PC和16:0/ 22:6Δ3,6,9,12,15,18-PC。
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備注:本文的彩色圖表可從本刊官網(http://lyspkj.ijournal.cn/ch/ index.axpx)、中國知網、萬方、維普、超星等數據庫下載獲取。
Egg yolk phosphatidylcholine enrichment in unsaturation fatty acids: Extraction and molecular structure
ZHU Shuai1, HUANG Meng-ling1, FAN Li1, YANG Rui-peng2, ZHANG Min2, LIU Yun1
(1. College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China; 2. Mille Dairy (Shanghai) Co. Ltd, Shanghai 200335, China)
Egg yolk is rich in phosphatidylcholine (PC), which is the keyphospholipid component providing nourishment and protection for our body. We herein optimize the ethanol extraction parameters for PC in egg yolk using response surface methodology. After preliminary purification through thin-layer chromatography, PCfatty acid compositions are identified by gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS), and their molecular structure are also elucidated by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectroscope (MALDI- TOF/MS). Results show that the optimal parameters for PC extraction from egg yolk are: weight/volume ratio of egg yolk to ethanol of 1∶16 (g:mL), ethanol concentration of 93.77%, extraction temperature of 42.98 ℃. Under the optimal conditions, 24.38% of PC yield is obtained, and PC content is approx.61.19% detected by UV-Vis spectroscopy. GC-MS analysis reveals that the main fatty acids of PC are oleic acid (40.66%), palmitic acid (16.35%), linoleic acid (13.06%), stearic acid (7.27%), palmitoleic acid (5.19%) and a small amount ofarachidonic acid (0.48%) and docosahexaenoic acid (0.37%). Nine kinds of PC molecular structures are elucidated from MALDI-TOF/MS profiles, namely, 16:0/18:0-PC, 16:0/18:1Δ9-PC,18:0/18:1Δ9-PC, 16:0/18:2Δ9,12-PC, 18:0/18:2Δ9,12-PC, 18:1Δ9/18:2Δ9,12-PC, 16:0/20:4Δ5,8,11,14-PC, 18:0/20:4Δ5,8,11,14- PC and 16:0/22:6Δ3,6,9,12,15,18-PC.
egg yolk; phosphatidylcholine (pc); ethanol extraction; fatty acid composition; molecular structure
TS201.1
A
1007-7561(2020)03-0010-08
10.16210/j.cnki.1007-7561.2020.03.002
2020-03-02
企業委托項目(H2019167)
朱帥,1997年出生,男,碩士生,研究方向為卵磷脂產品開發.
劉云(ORCID:0000-0002-7521-3831),男,教授,博導,研究方向為功能食品和生物資源利用, E-mail: liuyun@meil.buet.edu.cn
2020-04-17 11:08:13
http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3863.TS.20200417.1028.004.html