基于免疫磁珠黃曲霉毒素全自動凈化方法適用性評價

李 麗，葉 金，軒志宏，劉洪美，陳夢澤，周明慧，吳 宇，王松雪

專題報道（二）

基于免疫磁珠黃曲霉毒素全自動凈化方法適用性評價

李 麗，葉 金，軒志宏，劉洪美，陳夢澤，周明慧，吳 宇，王松雪

（國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037）

對基于免疫磁珠黃曲霉毒素全自動凈化的方法適用性進行研究。結果表明：免疫磁珠試劑盒平均回收率均在95%以上，相對標準偏差小于3.3%。質控樣品的測定結果均在給參考值范圍內。通過t檢驗可知，sig.（雙側）＝0.533，兩臺凈化儀的檢測結果沒有顯著性差異。通過62名檢測人員對黃曲霉毒素免疫磁珠自動化處理方法與傳統的免疫親和柱凈化法的評測，通過t-檢驗可知，99%的置信區間內，值≥0.01，說明兩種方法的測定值沒有顯著性差異，但是免疫磁珠自動化處理法測定結果的離散程度小于免疫親和柱法，且全部的檢測結果的|Z|均≤2。

免疫磁珠；黃曲霉毒素；自動化凈化；糧食；適用性評價

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFT）的毒性是氰化鉀的10倍，是砒霜的68倍，被世界衛生組織（WHO）的癌癥研究機構劃定為I類致癌物。黃曲霉毒素對人畜有強烈的致病性、致癌性，是危害最嚴重的真菌毒素之一，受到世界各國的廣泛關注[1]。其廣泛存在于玉米、花生及一些堅果類食品和飼料中，常見的黃曲霉毒素有B1、B2、G1、G2等四種[2]。國內外非常重視黃曲霉毒素的防控，我國在2017年最新頒布的國家食品安全標準GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》規定了玉米、玉米面（渣、片）及玉米制品中AFB1的限量為20 μg/kg，植物油脂（花生油、玉米油除外）中AFB1的限量為10 μg/kg，花生油、玉米油中AFB1的限量20 μg/kg，稻谷、糙米、大米中AFB1的限量為10 μg/kg，小麥、大麥、麥片、小麥粉、其它谷物及去殼谷物AFB1的限量為5 μg/kg[3]。

黃曲霉毒素的檢測方法研究進展很快,主要分為快速篩查法和準確定量法兩種。其中薄層色譜法[4]雖然成本低，但是操作繁瑣，重現性差。酶聯免疫吸附法[5]和膠體金試紙條法[6]多用于快速篩查，存在假陽性和假陰性。液相色譜串聯質譜法[7-8]可用于多種毒素同時篩查，但使用成本較為昂貴。免疫親和柱液相色譜法具有特異性強、靈敏度高和適用于多種復雜基質等特點，是目前國際上普遍采用的黃曲霉毒素精確定量和確認的方法[9-10]。但是，免疫親和柱-液相色譜法的前處理過程多為手動完成，存在實驗過程繁瑣，耗時長，對檢測人員的實驗技能要求高等問題[11-12]。

近年來，基于免疫磁珠真菌毒素凈化方法由于具有前處理簡單、自動處理、高效快速、便捷操作和結果可靠等優點[13-14]，越來越受到檢測人員的歡迎。其原理是樣品經提取液提取后，提取液中黃曲霉毒素特異性吸附在磁珠表面的抗體上，配合真菌毒素全自動凈化儀完成雜質洗滌和目標物洗脫等過程。本研究通過系統評估，驗證該方法在糧油黃曲霉毒素檢測中的適用性。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Sartorius BS224S電子天平：德國Sartorius公司；MX－F多功能旋渦混勻器：美國SCILOGEX公司；Waters I Class超高效液相色譜儀配大體積流通池：美國Waters公司；免疫磁珠試劑盒、真菌毒素全自動凈化儀：北京東方孚德技術發展中心；免疫親和柱：北京華安麥科生物技術有限公司；色譜級甲醇、乙腈：美國Fisher公司；黃曲霉毒素B1標準品：國家糧食和物資儲備局科學研 究院。

自然污染黃曲霉毒素有證標準物質和質控樣品：花生油中黃曲霉毒素B1質控樣、大米粉中黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮質控樣、糙米粉中黃曲霉毒素B1、玉米粉中黃曲霉毒素B1標準物質（GBW（E）100386）、玉米粉空白、小麥粉空白：由國家糧食和物資儲備局科學研究院提供

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理方法

參照GB5009.22—2016《食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》中第三法高效液相色譜-柱后衍生法（無衍生器法，大體積流通池直接檢測）進行[15]。準確稱取樣品（5± 0.005）g（感量0.001 g）樣品，加20 mL提取液甲醇-水（v/v：70∶30）并用渦旋混合器混勻1 min，置于渦旋振蕩器上提取20 min，然后以7 000 r/min，離心5 min，準確移取上清液0.5 mL加入免疫磁珠套合1孔位中，放入免疫磁珠凈化裝置中，按照設定的程序進行凈化處理，處理時間30 min，之后在5孔位加入0.5 mL水，混勻過膜上機檢測。

免疫磁珠試劑盒性能評價方法：按照上述方法處理玉米粉陰性樣本，獲得玉米粉陰性樣本的提取液，在提取液中添加2.5 ng/mL的黃曲霉毒素B1標準溶液，開展實驗。

方法準確性考察：本研究選取GBW（E）100386玉米全粉中黃曲霉毒素B1、大米粉中黃曲霉毒素B1質控樣、糙米粉中黃曲霉毒素B1等5種質控樣（自然污染樣品）按照1.2.1的處理及檢測。

臺間差考察方法：隨機選擇兩臺全自動凈化儀進行考察。參照免疫磁珠試劑盒性能評價方法進行。

1.2.2 儀器條件

WATERS I CLASS 配熒光檢測器（大體積流通池）。

色譜柱：Waters BEH-C18柱（2.1×100 mm，1.7 μm），柱溫：40 ℃。

流動相：A相：乙腈∶甲醇（體積比為1∶1）；B相∶水，A∶B=35∶65，等梯度洗脫。

流速為0.3 mL/min，進樣量為10 μL。

激發波長：365 nm；發射波長463 nm。

2 結果與分析

2.1 免疫磁珠試劑盒性能評價

由于免疫磁珠是基于“零長度EDC/NHS偶聯法”將黃曲霉毒素特異性偶聯到帶有多個位點的納米級磁球表面，可能存在黃曲霉毒素吸附或洗脫不全的問題，因此需對免疫磁珠的試劑盒性能評價。由于全自動凈化儀有10個磁棒，一次最多可裝10條試劑盒，故需對10個試劑盒進行評價，結果如下：

從表1可知，全自動凈化儀-免疫磁珠凈化試劑盒性能評測2次，每次評價10條試劑盒。試劑盒的平均回收率均在95%以上，相對標準偏差小于3.3%。滿足GB5009.22—2016附錄A中對黃曲霉毒素免疫親和柱柱回收≥80%的要求。因此，免疫磁珠凈化試劑盒具有與免疫磁珠相當或更優的凈化和吸附能力。

2.2 方法準確性考察

采用自然污染的有證標準物質或質控樣考察了基于全自動凈化儀-免疫磁珠凈化試劑盒檢測黃曲霉毒素方法的準確性，結果如下：

表1 全自動凈化儀-免疫磁珠凈化試劑盒性能評價結果 %

表2 五種質控樣品的測定結果

由上表可知，測定結果均在標定值擴展不確定度范圍之內，檢測結果滿意。

2.3 臺間差的評測

儀器臺間差的評價結果見表3。采用t檢驗法比較兩臺凈化儀的檢測結果是否有顯著性，sig.（雙側）＝0.533，表明兩樣本所屬總體平均數相等的概率＝0.533＞0.05，平均數間無顯著性差異，滿足LS/T 6402—2017《糧油檢驗設備和方法標準適用性驗證及結果評價一般原則》[16]的要求。

表3 臺間差儀器的檢測結果的t檢驗

2.4 免疫親和柱凈化法（國標法）和免疫磁珠自動化處理方法的評測

本研究分別采用免疫親和柱凈化法（國標法）和全自動凈化儀-免疫磁珠凈化試劑盒法對玉米粉中黃曲霉毒素B1質控樣品檢測，通過t檢驗和穩健Z值統計評價不同實驗人員操作對結果準確性和一致性。

2.4.1 兩組凈化方法檢測結果的t檢驗

采用t檢驗，評價兩種凈化方法的測定結果是否一致。

免疫磁珠凈化法測定結果的穩健平均值是11.35 μg/kg，免疫親和柱凈化法測定結果的穩健平均值是11.67 μg/kg，通過t檢驗，由表4可見，在99%的置信區間內，顯著性水平≥0.01，兩種方法之間的均值是沒有顯著性差異的。

2.4.2 檢測結果統計匯總

依據CNAS-GL02:2014《能力驗證結果的統計處理和能力評價指南》[17]，計算了結果總數、均值、中位值、穩健平均值、穩健標準差、穩健變異系數、極大值、極小值、極差等統計量，統計參數見表5。

表4 t檢驗分析結果

表5 檢測結果統計匯總表

由表5可知，免疫磁珠凈化法測定結果的極差是2.49 μg/kg，而免疫親和柱測定結果的極差值是3.659 μg/kg，說明免疫親和柱測定結果的離散程度大于免疫磁珠凈化法。采用免疫磁珠凈化檢測結果的標準偏差和穩健標準偏差低于免疫親和柱凈化檢測方法的結果。

2.4.3 檢測結果的評價

采用穩健值統計方法對結果進行統計分析并解釋。結果見圖1、2。

—指定值，通過迭代法計算得到穩健平均值；

—評定標準差，通過迭代法計算得到1.134倍的穩健標準差。

圖1 免疫親和柱凈化法測定結果Z值比分數分布圖

圖2 免疫磁珠凈化法測定結果Z值比分數分布圖

由圖可知，IAC凈化檢測62個結果中，60個結果｜｜≤2，結果滿意，滿意率是97%，有2個結果2＜｜｜＜3，結果為可質疑。IME凈化檢測62個結果全部｜｜≤2，結果100%滿意。

免疫磁珠凈化法實現了部分前處理自動化，只需完成稱樣和提取，操作簡單，大大降低了人員成本和對實驗人員實驗技能的要求，提高了檢測質量。該方法適合高通量樣品檢測，全自動凈化儀一次處理10個樣品時間約40 min，一天至少可凈化40個樣品，優于常規的免疫親和柱凈化，檢測效率高。

3 結論

本研究對黃曲霉毒素B1免疫磁珠自動化處理方法的適用性進行了評價。免疫磁珠試劑盒平均回收率均在95%以上，相對標準偏差小于3.3%，免疫磁珠凈化試劑盒具有與免疫磁珠相當或更優的凈化和吸附能力。通過有證基體標物或質控樣品準確性評價，測定結果均在給定值的不確定范圍內，檢測結果準確。全自動凈化儀的臺間差沒有顯著性差異。通過62位實驗人員對黃曲霉毒素B1免疫磁珠自動化處理方法與傳統的免疫親和柱凈化法的比較，由-檢驗可知兩者之間的測定值是沒有顯著性差異，但是免疫磁珠自動化處理法測定結果的離散程度小于免疫親和柱法，且全部的檢測結果的||均≤2。

黃曲霉毒素B1免疫磁珠自動化處理方法簡化了前處理過程，操作簡單，檢測成本低，很大程度上提高檢測效率和檢測水平。此外，免疫親和柱制備時需使用劇毒的CNBr活化瓊脂糖凝膠，免疫磁珠的制備則相對綠色、安全。通過適用性評價，該方法適用于糧食樣品檢測、監測。

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備注：本文的彩色圖表可從本刊官網（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/ index.axpx）、中國知網、萬方、維普、超星等數據庫下載獲取。

Evaluation of the applicability of an automatic method for aflatoxin purification based on immunomagnetic beads

LI Li, YE Jin, XUAN Zhi-hong, LIU Hong-mei, CHEN Meng-ze, ZHOU Ming-hui, WU Yu, WANG Song-xue

(Academy of National Food and Strategic Reserves Administration, Beijing 100037, China)

The objection was to evaluate the applicability of an automated method for aflatoxins analysis by using Immunoaffinity Magnetic Bead - UPLC. The results showed that the average recovery of the mmunoaffinity Magnetic Bead was above 95%, and the relative standard deviation was less than 3.3%. The results of the quality control samples were within the range of the reference uncertainty. The method was accurate and reliable.T testing (sig. (bilateral) = 0.533) proved that there was no significant difference between two independent purification instruments.62 researchers evaluated two methods of purifications with immunomagnetic beads and immunoaffinity column. T testing has proved that the results of the two methods were no significant difference.However, the dispersion degree of the immunomagnetic bead automated processing method was smaller than that of the immunoaffinity column method. Moreover, the z-value of all the test were less than 2 (| Z | ≤2). Hence, this method can detect cereals and oils. In addition, the method is environmentally friendly, simply, and lower-cost, which greatly improved detection efficiency and level.

immunomagnetic beads; aflatoxin; automatic purification; applicability evaluation; grain

TS207.3

A

1007-7561(2020)03-0037-05

10.16210/j.cnki.1007-7561.2020.03.006

2020-03-09

“十三五”國家重點研發計劃（2017YFC1601300）；中國科協青年人才托舉工程，中國科學青年人才托舉工程2018年-2020年項目（2018QNRC001）

李麗，1982年出生，女，助理研究員，研究方向為糧油質量安全與檢測.

王松雪，1977年出生，男，研究員，研究方向為糧油質量安全檢測與防控.

2020-04-18 13:06:01

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3863.TS.20200417.1653.006.html