北京市郊玉米質量安全風險因子及影響因素分析

崔 華，陸安祥，謝 剛，李 森，吳 宇，王松雪

專題報道（二）

北京市郊玉米質量安全風險因子及影響因素分析

崔 華1，陸安祥2，謝 剛1，李 森1，吳 宇1，王松雪1

（1. 國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037；2. 北京農業質量標準與檢測技術研究中心/農業部農產品質量安全風險評估實驗室（北京），北京 100097）

以北京郊區10個農戶的玉米種植地為研究對象，扦取種植期土壤樣品、揚花期花穗樣品、收獲期及不同儲藏時期的玉米樣品，檢測菌相、帶菌量和真菌毒素等。結果表明，玉米產后整個自然晾曬儲藏期間，儲藏前期（產后一個月內）的發霉風險最高，其中鐮刀菌屬一直是優勢菌群，其產生的毒素主要包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和伏馬菌素（FB1、FB2），檢出率分別為100%、95%和93%，且DON和ZEN在儲藏期的超標率均大于40%，而其他毒素，如AFBs、OTA、ST、T-2、HT-2等均未檢出。另外，采用高通量測序技術分析了土壤和花穗樣品中真菌多樣性與農藝因素的關系，發現，種植方式（清種/兼做）、灌溉情況、上季秸稈處理方式等因素會影響玉米植株污染真菌的種類和數量，進而導致玉米籽粒真菌毒素的污染水平出現差異。

玉米；質量安全；風險因子；真菌；真菌毒素；高通量測序

糧食在種植、收獲、儲藏和運輸等各個環節均會受到微生物的污染[1]，包括細菌、病毒和真菌等，其中真菌污染是影響糧食產量和品質的最主要因素，其產生的真菌毒素可在谷物食品和飼料中殘留，嚴重危及人類和動物的安全。因此，如何減少和控制真菌毒素對谷物的污染危害，已成為全世界普遍關注的問題[2]。糧食中真菌的生長和產毒主要受到基質水活度[3]、種類、完整性及溫度、通風、微生物相互作用和昆蟲等因素的共同影響[4]，通過建立影響因素與糧食真菌污染之間的關系，分析糧食發霉和產生真菌毒素的原因，將有利于實現預測和防控糧食霉變和真菌毒素的污染。

玉米是世界上重要的糧食、飼料和經濟作物，也是我國重要的糧食作物之一[5]。近年來我國玉米產量遠高于水稻和小麥（2014年—2018年國家統計局統計數據），位居我國糧食作物之首，玉米產量已成為影響我國糧食供求和畜牧業發展的重要因素[6]，玉米及其生產制品的質量與安全直接影響著我國農業的可持續發展和國民健康[7]。我國玉米霉變和真菌毒素污染多發易發，已成為影響玉米質量安全的主要問題，但是目前缺乏相關的預測防控技術研究。因此，研究影響玉米質量安全風險因子的主要種類、來源及其污染影響因素，將有助于實現玉米霉變和真菌毒素污染風險預測，進而結合相關科學干預技術，實現提前防控，從而保障糧食質量安全。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

土壤、玉米花穗和玉米樣品采集：北京市郊玉米種植區；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒：生工生物公司；土壤基因組DNA提取試劑盒：美國MP公司；高鹽察氏培養基（Salt Czapek-Dox Agar）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（Potato dextrose agar，PDA）：北京奧博星生物；乙腈、甲醇、乙酸銨、甲酸、乙酸（色譜純）：美國Fisher公司；0.2 μm聚四氟乙烯針頭過濾器：美國Pall公司；真菌毒素標準儲備溶液及種穩定同位素標準品：奧地利Biopure公司和美國Sigma公司。

1.2 實驗儀器

HVE-50高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司；SPX智能培養箱：寧波江南儀器廠；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；FastprepTM-24 快速樣品制備儀：美國 MP 公司；3-30K離心機：美國Sigma公司；GT10-1高速臺式離心機：北京時代北利離心機有限公司；Roto-Shake Genie多用途旋轉搖床：美國Scientific Industries公司；ACQUITY UPLC超高壓液相色譜儀：美國Waters公司；TSQ QUANTUM ULTRA四極桿串聯質譜儀：美國 Thermo Fisher Scientifific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品與農藝信息采集

2016年，在北京市郊玉米種植區內選取5個有代表性的產量大村，每個村隨機選擇兩個農戶做為研究對象，于播種期扦取土壤樣品；揚花期扦取花穗樣品；分別于收獲期、儲藏前期（儲藏一個月）、儲藏中期（儲藏兩個月）和儲藏后期（儲藏四個月）扦取玉米樣品，并對相關農藝信息進行登記。同時，與北京蘭亭實用技術開發有限公司合作，獲得該地區玉米揚花期至儲藏后期的相關氣象信息，包括溫度、濕度和降水量等（圖1）。

圖1 氣象信息匯總

1.3.2 樣品檢測

按照相關標準要求對玉米樣品進行水分、水活度、千粒重、生霉粒、帶菌量和菌相檢測。水分：GB/T 10362《糧油檢驗玉米水分測定》；水分活度：GB/T 34790《糧油檢驗糧食籽粒水分活度的測定儀器法》；千粒重：GB/T 5519《谷物與豆類千粒重的測定》；生霉粒：按照 GB/T 5494《糧油檢驗糧食、油料的雜質、不完善粒檢驗》及GB 1353《玉米》等國家標準的規定進行，并結合其他相關文獻資料進行判定；帶菌量：GB 4789.15《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》；菌相：GB 4789.16《食品安全國家標準食品微生物學檢驗常見產毒霉菌的形態學鑒定》，其中不同種類樣品的前處理按照以下方法操作：

土壤：將土壤樣品充分混勻后取適量放入無菌研缽中，加入少量無菌水，研磨成泥狀[8]，用無菌生理鹽水梯度稀釋后，取適宜濃度的土壤稀釋液涂布到高鹽察氏培養基和PDA培養基上，每個濃度做10個平板，倒置于28 ℃培養箱中培養10~14 d；花穗：將玉米花穗樣品剪成碎片，用無菌鑷子將其種植到高鹽察氏培養基和 PDA 培養基上，每個板接種5個點，每個樣品做10個平板，倒置于28 ℃培養箱中培養10~14 d；玉米：將玉米粒置入有效氯為3%的次氯酸鈉溶液中浸泡3 min后，用無菌水清洗樣品三次，再用無菌紙將表面殘留的水分吸干，無菌操作下將玉米顆粒種植到高鹽察氏培養基和PDA培養基中，每個平板10粒，每個樣品接種10個平板，倒置于28℃培養箱中培養10~14 d。

真菌毒素采用實驗室建立的《全碳標記穩定同位素內標-超高效液相色譜-串聯質譜法測定糧食中16種真菌毒素》方法進行檢測[9]。各種毒素的檢出限及定量限請見表1。糧食樣品中真菌毒素污染水平和差異分析采用Excel 2007和SPSS 20.0進行統計分析。

1.3.3 土壤和花穗樣品真菌群落分析

為進一步準確分析玉米生長期間污染的霉菌來源及其影響因素，選取了其中6個有代表性的農戶作為研究對象，提取土壤及花穗樣品中攜帶的全部真菌基因組DNA（試劑盒法），送至金唯智生物科技有限公司進行高通量ITS測序及生物信息學分析。

表1 各種毒素的檢出限和定量限 mg/kg

注：黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、赭曲霉毒素A (OTA)、HT-2毒素(HT-2)、T-2毒素(T-2)、雪腐鐮刀菌烯醇(NIV)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、DON-3-葡萄糖苷(DON-3G)、3-乙酰基DON (3-AcDON)、15-乙酰基DON (15-AcDON)、雜色曲霉毒素(ST)、伏馬毒素B1(FB1)、伏馬毒素B2(FB2)。

2 結果與分析

2.1 水分、水活度、生霉粒和帶菌量

該地區玉米收獲期集中在十月上旬，此時期降水量較大，平均39.9 mm，空氣相對濕度也較高，平均為74%（見圖1），且玉米收獲后直接堆放在地面，不能及時晾干，這將有利于霉菌的生長繁殖，加重霉菌污染的風險。如圖2所示，從水分檢測結果來看，10個農戶的玉米水分在儲藏的前兩個月一直處于“安全水分”（13%）之上。各農戶玉米樣品水活度在前三個扦樣時期呈緩慢下降趨勢，至儲藏后期，仍然有三分之一的農戶玉米水活度在0.7以上（一般糧食水活度在0.7以下時對應的水分值均能抑制各類微生物的生長[10]）。

各農戶玉米樣品儲藏前期的帶菌量與收獲期相比除農戶9外均有增加，而生霉粒的檢測結果也顯示，隨著儲藏時間的延長，各農戶檢出率總體呈上升趨勢（生霉粒檢測采用的是感官檢驗，主觀因素影響很大，存在一定的系統誤差）。

綜合以上檢測結果分析發現，該地區玉米在收獲后的四個月內，一直存在著霉變風險，其中收獲后一個月內的發霉風險最高。

2.2 菌相

通過菌相檢測，獲得了土壤樣品中含有的優勢產毒真菌種類，主要為交鏈孢霉屬（） 和鐮刀菌屬（）；通過分離檢測玉米外部花穗、內部花穗、外葉、中葉和內葉五個部分的菌相發現，玉米花穗樣品攜帶的產毒真菌同土壤樣品相似，且攜帶量由外往內逐漸減少，證實產毒真菌是通過花穗外部逐漸往里侵染，其來源為土壤的可能性較大。

從玉米樣品菌相檢測結果來看（圖3），各時期均以鐮刀菌屬為優勢菌，其中禾谷鐮刀菌（）、輪枝鐮刀菌（）和尖孢鐮刀菌（）占比較大，它們是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和伏馬毒素的主要產生菌。其次含量較高的產毒真菌是曲霉屬和青霉屬，其中農戶6和9收獲期的玉米樣品中含有大量的黑曲霉，從農藝信息上看，這兩個農戶與其他農戶的最大區別是種植方式為果樹兼做種植，說明兼做種植方式會對菌相產生一定的影響。綜合研究各農戶農藝信息與各檢測數據的關系，未得出其他相關性結論，這是由于不同種植情況的樣本數不足導致的。

圖2 玉米水活度、水分、生霉粒和帶菌量檢測結果

注：由于農戶9在儲藏后期扦樣前已將全部玉米賣出，所以沒有該時期的檢測數據。

圖3 玉米菌相檢測結果

2.3 真菌群落分析

表2顯示的是6個代表農戶的土壤和花穗樣品屬水平下常見產毒霉菌的存在情況。除農戶7外，其他均為交鏈孢霉屬和鐮刀菌屬均占比較大，這與菌相的檢測結果是一致的。對比農藝信息發現，農戶7的特殊之處在于種植期間用井水灌溉過，而其他農戶均未對農田進行灌溉，這就導致土壤污染了大量的木霉屬菌種。

表2 屬水平下主要物種百分比統計表

注：T1、T3、T5、T7、T8、T9 分別代表土壤樣品；S1、S3、S5、S7、S8、S9 分別代表花穗樣品。所有的赤霉菌都是鐮刀菌的有性階段。

通過對原始數據進行去接頭和低質量過濾處理，然后去除嵌合體序列，最終得到有效序列后進行聚類分析，每一個聚類稱為一個物種操作單元（operat ional taxonomic units，OTU），對OTU的代表序列作分類學分析，得到各樣本的物種分布信息。根據OTU聚類分析結果，分析不同樣本/分組共有和特有的OTU，繪制韋恩圖（Venn，圖4），可以看出，各農戶土壤樣品含有的真菌種群數量明顯多于花穗樣品，且二者共有部分真菌種群。其中，農戶1、3和8的土壤真菌種群數量明顯多于其他農戶，這三個農戶的共同點是上季秸稈處理方式為歸田，這與秸稈還田處理會擴大土壤微生物種類和數量的相關報道是相符的[11]。

圖5顯示的是多樣本比較分析weighted unifrac距離矩陣熱圖，可以看到，各農戶花穗樣品的相異系數大部分在0~0.3之間，說明此地區玉米花穗攜帶的真菌群落差異不大，只有農戶1與其他農戶的相異系數> 0.3，這是因為農戶1的地理位置最偏（在該地區的最東邊，與最近一個農戶的距離為21公里），而其他農戶相對較集中，直徑范圍大概為28公里，說明在一定范圍內的區域中，空氣、雨水、蟲害等對玉米真菌群落的影響沒有太大差異[12]。而農戶9的土壤真菌攜帶情況與其他農戶差異較大，分析其農藝信息發現，農戶9與其他農戶存在多處不同，包括人工播種、兼做果樹種植、沒有使用肥料，說明這些農藝因素也會造成土壤的真菌群落差異。

圖4 OTU聚類分析Veen圖

注：韋恩圖中不同顏色的圈表示不同的樣本/分組，圖中的數字分別代表了每個樣本/分組特有或共有的OTU數目。

圖5 weighted unifrac距離矩陣熱圖

注：weighted unifrac距離矩陣熱圖，熱圖中顏色深淺代表了樣本兩兩之間的相異程度，顏色越淺表示兩個樣本相異系數越小，物種多樣性的差異越小。

2.4 真菌毒素含量

如表3所示，該地區玉米污染的真菌毒素主要是嘔吐毒素（DON及其衍生物DON-3G、3-Ac DON、15-Ac DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN)和伏馬毒素（FB1、FB2）。在收獲期、儲藏前期、儲藏中期和儲藏后期四個扦樣時期內，DON污染最為嚴重，檢出率為100%，超標率分別為22%、44%、40%和67%；ZEN的檢出率為95%，超標率分別為0%、44%、40%、56%；伏馬毒素的檢出率為93%（沒有限量），毒素污染均總體呈上升趨勢；而其他毒素，如AFBs、OTA、ST、T-2、HT-2等均未檢出。

由此可以判斷，霉菌在玉米產后儲藏兩個月的時期內一直處于非常活躍的狀態，繁殖代謝旺盛，這應該是由于此時期內環境溫度還在0 ℃以上，濕度也較大，且玉米還具有后熟作用，堆積在一起后會產生一定的水分及熱量，非常有利于霉菌的生長。而在儲藏第三、四個月時，環境溫濕度均下降很大，玉米自身水分也降低了許多，因此其攜帶的真菌生長繁殖速度減慢甚至停止。

表3 各時期玉米樣品毒素含量檢測結果 μg/kg

注：表中顯示的各扦樣時期毒素值為所有農戶玉米樣品毒素含量的總值。毒素限量參考GB 2761—2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》，分別是：DON 1 000 μg/kg；AFB120 μg/kg；ZEN 60 μg/kg；OTA 5.0 μg/kg。

3 結論

糧食真菌和真菌毒素污染在種植、收獲、儲藏和運輸等各個環節均有可能發生，一旦條件合適，有害真菌便會大量生長繁殖，產生真菌毒素，其中天氣因素、農藝因素[13]、收獲后的處理方式、儲藏方式等都會對真菌毒素的產生造成很大的影響。該地區玉米的收獲模式以人工為主，收獲期雨水較多，且在收獲后直接堆放成囤，不利于玉米散熱，卻有利于霉菌的生長繁殖，加重了真菌毒素的污染風險。通過研究發現，鐮刀菌屬在玉米的整個自然晾曬儲藏期間一直是優勢菌種，其代謝產生的毒素主要為DON、ZEN和伏馬菌素（FB1、FB2），檢出率分別為100%、95%和93%，且DON和ZEN在儲藏期的超標率均大于40%，這就明確了影響該地區玉米質量安全的主要風險因子。

建立糧食真菌和真菌毒素污染與影響因素之間的關系，分析糧食發霉和產生真菌毒素的原因，將有利于實現預測和防控糧食霉變和真菌毒素的污染。本研究首次嘗試使用高通量測序技術分析真菌群落結構與農藝因素的關系，以確定玉米污染真菌的來源及其影響因素，結果證實該技術快速有效。將該技術與農藝信息相結合，能夠篩選出影響土壤、花穗真菌群落種類的有效因素，如種植方式（清種/兼做）、灌溉情況、上季秸稈處理方式等，這些農藝因素同本地氣象信息均可以做為預測玉米霉變和真菌毒素污染的輸入因子。但是，只分析單一因素的影響結果很難得出結論，需要采集大量樣本，對多種影響因素綜合分析才能得出較全面的結論。

為了防控玉米霉變和真菌毒素污染帶來的風險，應該加強對農民開展有關玉米種植監管方面的知識培訓，強化農民的農產品質量安全意識[14]，從種植、收獲及儲藏等環節進行預防[15]。適時播種；做好田間監管工作，采取合理的預防措施防治病蟲害，例如，藥劑拌種、土壤殺菌[16]、揚花期殺菌等；確保及時收獲并在收獲后盡快晾曬減少水分；避免過密堆積儲藏，影響通風等。這樣可以有效的阻止或者減慢真菌的生命活動，從而降低真菌毒素污染的風險，保障玉米質量安全。

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備注：本文的彩色圖表可從本刊官網（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/ index.axpx）、中國知網、萬方、維普、超星等數據庫下載獲取。

Analysis of risk factors and influencing factors of corn quality and safety in suburbs of Beijing

CUI hua1, LU An-xiang2, XIE Gang1, LI Sen1, WU Yu1, WANG Song-xue1

(1. Academy of National Food and Strategic Reserves Administration, Beijing 100037, China; 2. Beijing Research Center for Agricultural Standards and Testing (BRCAST) Risk Assessment Lab for Agro-products (Beijing), Ministry of Agriculture. P. R. China, Beijing 100097, China)

Taking the corn plantation area of 10 farmers in the suburbs of Beijing as the research object, soil samples from the planting period, flower spike samples from the flowering period, corn samples from the harvest period and different storage periods were taken to detect the mycoflora, microbial contamination and the mycotoxins. The results show that during the whole post-harvest natural drying period of corn, the risk of mold formation is highest in the early storage period (within one month after harvest). Among them,has always been the dominant flora, and the toxins produced by it mainly include deoxynivalenol (DON), Zearalenone (ZEN), and fumonisin (FB1, FB2), the detection rates were 100%, 95%, and 93%, respectively, and the over-standard rates of DON and ZEN during the storage period were greater than 40%, and other toxins such as AFBs, OTA, ST, T-2, and HT-2 were not detected. In addition, the high-throughput sequencing technology was used to analyze the relationship between fungal diversity and agronomic factors in soil and spike samples, and it was found that factors such as planting methods, irrigation conditions, and last season's straw treatment methods could affect corn. The type and quantity of plant-contaminated fungi resulted in differences in the levels of corn kernel mycotoxins.

corn; quality and safety; risk factors; fungi; mycotoxins; high-throughput sequencing

TS210.2

A

1007-7561(2020)03-0054-07

10.16210/j.cnki.1007-7561.2020.03.009

2020-03-09

農業部農產品質量安全風險評估實驗室（北京）、農產品產地環境監測北京市重點實驗室開放課題（kfkt2016）

崔華，1986年出生，女，碩士，助理研究員，研究方向為糧食真菌檢測技術研究.

王松雪，1977年出生，男，博士，研究員，研究方向為糧油質量與安全檢驗監測與防控.