黑豆皮可溶性膳食纖維對糖尿病小鼠抗炎因子的調節作用

沈 蒙，王維浩,，康麗君，葛云飛，康子悅，肖金玲，全志剛，王 娟，劉德志，趙姝婷，王金滿，曹龍奎,,*

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319;2.黑龍江八一農墾大學 國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319;3.黑龍江八一農墾大學 農業農村部農產品及加工品質量監督檢驗測試中心，黑龍江 大慶 163319）

糖尿病是由于胰島功能部分缺失導致胰島素（insulin，INS）抵抗或INS分泌不足等癥狀引起的一種最常見的內分泌疾病，通常伴有細胞因子介導的炎性反應的發生[1]。調查結果顯示，現今，全世界已有2億多人患有糖尿病，到2025年，將有3億 人患糖尿病[2]，每年導致290多萬人死亡，未來30 年這一數字還將上升[3]。臨床上緩解糖尿病等癥狀的磺脲類或雙胍類降糖藥物，伴有嚴重的副作用，如惡心、嘔吐、食欲下降、腹痛、腹瀉、過敏等癥狀[4]。因此，研究學者從飲食方面著手，探究尋找可以緩解預防糖尿病等癥狀的天然營養成分，既可以緩解糖尿病等癥狀，同時又無副作用[5]。

可溶性膳食纖維指不能被人體消化酶消化分解，可溶于熱水的非淀粉多糖，如低聚糖、果膠和樹膠之類的物質等，可以調節血糖血脂、控制肥胖、抑制腫瘤生長、促進腸道蠕動等[6-8]。研究表明，可溶性瓜爾膠纖維可以改善肥胖C57BL/6小鼠的體質量、血糖水平、INS分泌量?？扇苄陨攀忱w維可以降低糖尿病大鼠餐后血糖濃度，增加INS分泌，改善糖尿病大鼠攝食量和體質量，降低血漿中葡萄糖的濃度[9-11]。黑豆皮是黑豆加工制油過程中的副產物，其價格低廉，且在加工過程中大多被遺棄，少部分被用作飼料，這無疑是一種浪費。黑豆皮中除了有較高含量的色素、油脂和蛋白質外，膳食纖維的含量也較高[12]。

本實驗在Ma Mengmei[13]和佐兆杭[14]等的研究基礎上，以低劑量鏈脲佐菌素多次腹腔注射建立2型糖尿病小鼠模型，黑豆皮膳食纖維灌胃劑量為600 mg/kgmb（250 μL/只），研究其對糖尿病和炎癥因子水平的影響，為黑豆皮可溶性膳食纖維降血糖功能提供理論依據，同時為黑豆皮副產物開發增加經濟價值。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

7 周齡雄性C57/BL6小鼠，購于遼寧長生生物技術股份有限公司，生產許可證號：SCXK（遼）2015-0003。

黑豆皮可溶性膳食纖維粉（純度為95%以上）國家雜糧技術研究中心;鏈脲佐菌素 美國Sigma公司;二甲雙胍 沈陽市華東試劑廠;小鼠血清INS、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-4（interleukin 4，IL-4）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）測試盒 南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析級。飼料配方如表1所示。

表 1 飼料配方Table 1 Diet formulation for mice

1.2 儀器與設備

血糖儀 上海羅氏診斷儀器有限公司;GDE-CSF6膳食纖維測定儀 意大利VELP公司;QBS-200B型氣爆工藝試驗臺 鶴壁正道生物能源公司;MR-96A酶標儀深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司;AR2140電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑豆皮可溶性膳食纖維的制備

制備工藝流程：黑豆皮→蒸汽爆破改性（壓強1.0 MPa、時間80 s、水分質量分數15%）→烘干→粉碎（60 目）→耐高溫α-淀粉酶處理→中性蛋白酶處理→葡萄糖苷酶處理→過濾→體積分數95%乙醇溶液醇沉→冷凍干燥→粉碎（100 目）→黑豆皮可溶性膳食纖維粉

1.3.2 模型建立

選擇7 周齡健康雄性C57/BL6小鼠35 只，體質量（22±2）g。適應性飼養一周后，稱量體質量，按體質量隨機抽取7 只作為空白組，其余小鼠禁食12 h后，腹腔注射鏈脲佐菌素50 mg/kgmb，連續注射5 d后禁食12 h，斷尾取血測血糖濃度，當血糖濃度大于11.11 mmol/L時，且陸續出現多飲、多食、多尿癥狀的小鼠（21 只）為糖尿病模型小鼠[15]，共分為3 組（模型組、陽性藥物組和膳食纖維組），每組7 只。空白組及模型組灌胃給予生理鹽水（質量分數0.9% NaCl），陽性藥物組灌胃二甲雙胍（100 mg/kgmb），膳食纖維組灌胃給予（600 mg/kgmb）黑豆皮可溶性膳食纖維溶液，灌胃劑量為250 μL/只，連續灌胃28 d。實驗期內，各組小鼠均不限制攝食量與飲水量，每周定時稱量小鼠體質量1 次。恒定溫度（22±2）℃和相對濕度（55±10）%，晝夜交替12 h/d。動物飼養和處理遵循中國實驗動物科學協會實驗動物福利和倫理委員會的規定[16]。

1.3.3 動物檢測指標測定

1.3.3.1 動物體質量的測定

實驗期間觀察實驗小鼠日常行為狀況并記錄，末次給藥并禁食禁水24 h后，稱量并記錄小鼠體質量，每周一次[14,17]。

1.3.3.2 動物降血糖指標的測定

眼眶采血法收集血液，12 000 r/min離心10 min，血清于-20 ℃保存，通過相應試劑盒測定INS、TNF-α、IL-4、CRP質量濃度。

1.3.3.3 組織病理學觀察

將小鼠的胰腺置于體積分數10%福爾馬林溶液中，用乙醇脫水，包埋在石蠟中，切成4 μm切片，并用蘇木精-伊紅染色，制成切片，在顯微鏡下觀察胰腺的組織形態學結構[17]。

1.4 數據統計與分析

每個實驗重復3 次，得到的測試數據采用平均值±標準偏差的形式表示，通過Microsoft Excel 2003和SPSS 20軟件進行單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果與分析

2.1 黑豆皮可溶性膳食纖維對糖尿病小鼠體質量的影響

圖 1 各組小鼠體質量及攝食量的變化Fig. 1 Changes in body mass and food intake of mice in each group

由圖1A可知，0 周時，低劑量鏈脲佐菌素誘導糖尿病模型組明顯低于非糖尿病組小鼠體質量。經灌胃給予二甲雙胍和可溶性膳食纖維后，1～4 周實驗期間內，糖尿病組小鼠體質量持續下降，空白組、陽性藥物組和可溶性膳食纖維組小鼠的體質量隨著時間的延長，呈現緩慢上升的趨勢，相較于0 周時，4 周實驗后，分別增長了9.58%、7.84%和6.95%。由圖1B可知，0 周時，低劑量鏈脲佐菌素誘導糖尿病模型組明顯高于非糖尿病組小鼠攝食量。經灌胃給予二甲雙胍和可溶性膳食纖維后，1～4 周實驗期間內，空白組和糖尿病組小鼠攝食量持續上升，陽性藥物組和可溶性膳食纖維組小鼠的攝食量隨著時間的延長，呈現緩慢下降的趨勢。該結果說明黑豆皮可溶性膳食纖維可以有效改善糖尿病小鼠的體質量和攝食量。

2.2 黑豆皮可溶性膳食纖維對糖尿病小鼠血糖濃度的影響

圖 2 各組小鼠空腹血糖濃度變化Fig. 2 Change in blood glucose concentration of mice in each group

由圖2可知，在0 周時，空白組與低劑量鏈脲佐菌素誘導糖尿病小鼠的空腹血糖濃度有顯著性差異（P＜0.05），但糖尿病小鼠各組間空腹血糖濃度均沒有顯著差異。在1～4 周實驗期間的每個時間段，相較于糖尿病模型組，陽性藥物組和可溶性膳食纖維組小鼠的空腹血糖濃度顯著降低（P＜0.05），但陽性藥物組與可溶性膳食纖維組無顯著差異。該結果表明，黑豆皮可溶性膳食纖維可顯著降低糖尿病小鼠的空腹血糖濃度。

2.3 黑豆皮可溶性膳食纖維對糖尿病小鼠INS水平的影響

圖 3 各組小鼠INS水平變化Fig. 3 Changes in insulin concentration of mice in each group

由圖3可知，與空白組相比，糖尿病模型組小鼠血清INS水平增加了71.28%（P＜0.05）;相較于糖尿病模型組，灌胃給予二甲雙胍和可溶性膳食纖維組小鼠血清INS水平分別降低了29.52%（P＜0.05）和11.10%，且可溶性膳食纖維組與陽性藥物組小鼠血清INS水平沒有顯著性差異。說明黑豆皮可溶性膳食纖維可降低糖尿病小鼠的INS水平。據調查研究結果表明，糖尿病INS水平與INS敏感性呈負相關，即當INS水平較低時，INS敏感性較高[18]。富含膳食纖維的谷物、果皮類可以有效地改善糖尿病小鼠INS敏感性[19]。本研究表明，改性黑豆皮SDF可以有效地提高糖尿病小鼠INS敏感性，對II型糖尿病有一定的緩解作用，與上述學者研究結果相一致。

2.4 黑豆皮可溶性膳食纖維對糖尿病小鼠抗炎因子水平的影響

圖 4 各組小鼠血清TNF-α（A）、IL-4（B）和CRP（C）水平的變化Fig. 4 Changes in serum TNF-α (A), IL-4 (B) and CRP (C) levels in mice in each group

由圖4可知，糖尿病模型組小鼠相較于空白組，TNF-α和CRP質量濃度顯著升高（P＜0.05），IL-4質量濃度顯著降低（P＜0.05）。灌胃給予二甲雙胍和可溶性膳食纖維組小鼠相較于模型組小鼠的TNF-α質量濃度顯著降低（P＜0.05），且陽性藥物和可溶性膳食纖維組小鼠的TNF-α質量濃度存在顯著差異（P＜0.05）;陽性藥物和可溶性膳食纖維組小鼠相較于模型組小鼠的IL-4質量濃度顯著提高（P＜0.05），且陽性藥物和可溶性膳食纖維組小鼠的TNF-α質量濃度存在顯著差異（P＜0.05）;陽性藥物和可溶性膳食纖維組小鼠相較于模型組小鼠的CRP質量濃度顯著降低（P＜0.05），且陽性藥物和可溶性膳食纖維組小鼠的TNF-α質量濃度存在顯著差異（P＜0.05）。

2.5 糖尿病小鼠胰腺組織病理學觀察與分析結果

圖 5 各組小鼠胰腺病理組織切片Fig. 5 Pathological sections of pancreatic tissue of mice in each group

由圖5可知，空白組小鼠的胰島呈橢圓形或近似圓形，面積較大、結構完整，β細胞分布規則、大小均勻、排列完整，細胞質內INS的分泌顆粒多，而且染色較深，未見變性，且胰島與β細胞邊界清晰可見。糖尿病模型組小鼠的胰腺重度萎縮，胰島面積重度縮小，β細胞嚴重變性，分布不均勻，排列松散，邊界不規則且模糊不清。灌胃給予二甲雙胍和可溶性膳食纖維后，糖尿病小鼠的胰腺有明顯的改善，胰島面積顯著增大，β細胞的數量顯著增多，且細胞水腫變形程度改善，細胞間隙偶有炎性細胞浸潤現象，細胞質內的INS分泌顆粒增加，邊界較清晰。胰腺病理組織切片結果表明：黑豆皮可溶性膳食纖維對2型糖尿病小鼠的胰島面積和β細胞有明顯的修復能力，進而在一定程度上增加INS的分泌量和糖原合成量，導致機體血糖水平降低。

3 討 論

膳食纖維作為第七大類營養物質，具有不易被機體消化吸收的特點[20]，攝入可溶性膳食纖維可有效延緩和降低餐后血糖和血清INS水平的升高，維持餐后血糖水平，從而降低機體血液中葡萄糖含量，緩解2型糖尿病等癥狀[21]。

研究表明，膳食纖維具有調節餐后血糖濃度、升高血清INS水平及維持血糖平衡和穩定等功能[25]，其中可溶性膳食纖維可以改善INS敏感性和葡萄糖耐量，從而預防和治療2型糖尿病的發生[26]。攝入黏性膳食纖維（主要是可溶性膳食纖維）有助于降低血漿膽固醇水平、調節血糖濃度和使INS水平正?；虼丝梢越档吞悄虿『托哪X血管疾病的發病率[16]。在機體消化道內，可溶性膳食纖維可以減緩餐后血糖及INS反應，從而減少饑餓感[27]，降低體質量及血糖水平。研究表明，TNF-α、IL-4和CRP等非特異性炎癥因子與糖尿病的發病機制相關[28-29]。通過研究糖尿病小鼠的空腹血糖濃度和INS水平，發現黑豆皮可溶性膳食纖維具有較好的血糖調節功能。其原因可能為黑豆皮可溶性膳食纖維刺激了殘存β細胞分泌INS，提高了末梢組織對INS的敏感性，顯著改善糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力，降低了對INS的需求量，有利于糖原的合成作用，從而降低血糖水平和INS水平[22-24]。TNF-α能夠介導INS受體使之成為INS受體的抑制劑，因此TNF-α的過度表達會介導INS抵抗[30]。實驗結果顯示，灌胃給予黑豆皮可溶性膳食纖維組小鼠相較于糖尿病模型組小鼠的TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）。IL-4是一種人體內多種細胞產生的具廣泛生物活性的細胞因子，IL-4是T細胞分泌的細胞因子，參與激活免疫細胞，促進B細胞增殖和分化，在調節體液免疫中起關鍵性作用[31]。研究結果表明，相較于模型組小鼠，可溶性膳食纖維組小鼠的IL-4水平顯著升高（P＜0.05）。CRP是預測糖尿病一個指標，機體組織在損傷和各種炎癥刺激后才產生，且CRP的過度表達會導致INS對抗[32]。研究結果表明，相較于模型組小鼠，可溶性膳食纖維組小鼠的CRP質量濃度顯著降低（P＜0.05）。上述結果說明黑豆皮可溶性膳食纖維對糖尿病小鼠抗炎因子具有調節作用。在誘導糖尿病模型階段，低劑量鏈脲佐菌素多次腹腔注射對小鼠胰島β細胞有選擇性破壞作用，使其嚴重萎縮，從而減少INS的分泌，最終使小鼠血糖水平升高，引起2型糖尿病。在攝入黑豆皮可溶性膳食纖維后，糖尿病小鼠的胰島面積和β細胞數增加，胰島和β細胞有一定程度修復。

綜上所述，黑豆皮可溶性膳食纖維具有較好的緩解糖尿病小鼠體質量，血糖、INS水平和抗炎因子的濃度，修復受損傷的胰島組織的功能。本實驗為黑豆皮可溶性膳食纖維產品的開發利用提供了理論依據。