桑葉槲皮素對D-半乳糖致衰老小鼠抗氧化能力及腸道菌群的影響

黃思瑩， 黃春萍， 劉 旭， 佘詩琪， 勾 洵

（四川師范大學 生命科學學院，四川 成都610101）

衰老是一種復雜的生理過程，是機體隨著年齡的增加而出現的各生理器官和功能的退行性變化.隨著現代醫學和生物學的迅速發展，自由基學說成為最具有代表性的可能機制之一：隨著年齡的增大，生物體中清除自由基的抗氧化酶活性下降，自由基逐漸堆積從而加速衰老［1］.因此，如何清除生物體內過量的自由基已經成為抗氧化研究的重難點問題，天然產物所具有的安全無副作用及特有的多種生物活性物質受到了越來越多的關注.作為“藥食同源”的重要植物資源，桑葉（Morus alba L.）具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖和降低膽固醇等多種藥理作用，含有多糖、氨基酸、黃酮、維生素等多種生物活性組分［2-4］.與多糖類似，黃酮類化合物是桑葉主要活性成分之一，具有多種藥理作用和活性功能.文獻［5］報道桑葉黃酮類化合物含量在所有植物莖葉中較高，占桑葉干物質量的3%左右.研究顯示，桑葉黃酮類化合物能清除人體中超氧離子自由基，是一類天然抗氧化劑，但其作用機制仍不明確.此外，不同種類和不同結構的黃酮類化合物的抗氧化功效均不相同［5-6］.作為多羥基黃酮類化合物，槲皮素（quercetin）被現代醫學研究證明具有抗腫瘤、降血糖和降血脂等作用［7-8］.桑葉槲皮素（MAQ）對衰老小鼠的抗氧化作用和其攝入后對小鼠腸道菌群的影響及機制未見報道.本研究以桑葉槲皮素為研究對象，研究其對D -半乳糖致衰老模型小鼠免疫功能、抗氧化能力以及腸道菌群多樣性的影響，以期探索桑葉槲皮素在預防衰老方面的作用.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 桑葉，購自于當地農貿市場，經四川師范大學生命科學學院植物學教研室鑒定為桑葉.

總抗氧化能力（T -AOC）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）、糞便基因組提取試劑盒（中國天根生化科技有限公司）、蘆丁標準品（四川省維克奇生物科技有限公司），石油醚、乙醇、抗壞血酸、D -半乳糖、亞硝酸鈉、硝酸鋁和NaOH 等均為國產分析純.

1.2 儀器與設備 電子天平（萬分之一，賽多利斯科學儀器北京有限公司），超聲清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），臺式低溫冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），紫外可見分光光度計Spekoll 500（AJ 耶拿），旋轉蒸發儀R -3（Buchi），電泳儀（Bio-RAD），凝膠成像系統（Bio-RAD）.

1.3 實驗動物 ICR 小鼠60 只，雄性，18 ～22 g，購自四川省成都達碩實驗動物有限公司（生產許可證：SCXK（川）2015 -030）.小鼠自由進食、飲水，室溫保持25 ℃左右（動物實驗許可證：SYXK（川）2013 -185）.

1.4 試驗方法

1）桑葉中槲皮素的提取［9］.將桑葉粉與石油醚以1∶ 20 的比例，在50 ℃、200 W的條件下超聲波處理20 min，過濾出殘渣，將殘渣重復提取一次；隨后將殘渣放置70 ℃烘箱烘干；按料液比1∶ 25的比例加入體積分數為50%的乙醇溶液，超聲波提取3 次（溫度70 ℃，功率200 W，時間30 min）；抽濾，合并濾液后利用旋轉蒸發儀，真空減壓濃縮，回收乙醇.利用蘆丁標準液建立標準曲線的方法檢測槲皮素含量.

2）動物分組與衰老模型建立. ICR 雄性小鼠60 只，適應性喂養3 d 后，隨機分為空白對照組（CG）、衰老模型組（MG）、陽性對照組（PC）、MAQ高（MAQ - H）、MAQ 中（MAQ - M）和MAQ 低（MAQ-L）劑量組.空白對照組腹腔注射0.9%生理鹽水；其余5 組腹腔注射D -半乳糖120 mg／（kg·d），持續8 周建立小鼠衰老模型.

3）槲皮素的灌胃治療.建模完成后，桑葉槲皮素低、中、高劑量組分別灌胃50、100、200 mg／（kg·d）；陽 性 對 照 組 灌 胃 抗 壞 血 酸100 mg／（kg·d）；空白對照組與衰老模型組給予等量的生理鹽水灌胃，給藥持續30 d.

4）指標檢測及方法.治療結束后禁食1 d，眼球采血，根據試劑盒說明書檢測GSH - Px 活性、T-AOC、SOD活性和MDA 含量.同時無菌條件下取小鼠胸腺、脾臟，稱重并計算胸腺、脾臟指數如下：

5）小鼠腸道細菌總DNA提取.小鼠灌胃治療期間，每10 d 測量小鼠體質量并收集小鼠新鮮糞便.稱取0.2 g糞便樣品，按照糞便基因組提取試劑盒使用說明操作.通過超微量核酸蛋白測定儀以OD260／OD280 評價DNA的純度并測定DNA濃度，-20 ℃低溫保存備用.

6）16S rDNA V3 可變區PCR擴增.利用帶GC夾子的細菌通用引物對16S rDNA 的V3 區進行PCR擴增.引物序列為341F -GC：5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGC CTACGGGAGGCAGCAG-3'和534R：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG - 3'. PCR 反應體系（25 μL）：ddH2O 8. 5 μL，2 × Easy Taq PCR Super Mix 12.5 μL，上下游引物均為1 μL，DNA 模板2 μL.PCR 反應條件：94 ℃，預變性5 min，94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；共30 次 循 環；72 ℃，10 min；4 ℃保存.1.0%瓊脂糖電泳檢測PCR產物.

7）變性梯度凝膠電泳（DGGE）.本次實驗使用美國Bio -Rad 公司Dcode DGGE 系統，將16S rDNA V3 區的PCR 擴增產物于8%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離.變性劑質量分數范圍為30% ～60%，變性梯度方向與電泳方向一致，電泳在恒溫60 ℃下的1 ×TAE緩沖液中進行，90 V電泳8 h，電泳結束后使用AgNO3染色，凝膠成像系統檢測并用Quantity One? v4.6.2（Bio -Rad，Hercules，CA）軟件（簡稱Quantity軟件）拍照記錄結果.

8）腸道菌群的多樣性分析.利用Quantity軟件將PCR-DGGE圖譜變換為條帶圖譜和波峰圖譜，采集圖中條帶數目和灰度值，然后用Shannon -Weaver（H′）指數來分析各組小鼠腸道菌群的多樣性，

公式中ni為個體第i條條帶的峰面積，N為此個體所有條帶的峰面積之和.

9）數據分析.所得數據經SPSS 20.0 軟件處理，正態性檢驗后，服從正態分布的數據以ˉx ±s表示，進行單因素方差分析.

2 結果與分析

2.1 桑葉槲皮素對小鼠胸腺、脾臟指數的影響 與空白對照組相比，衰老模型組的胸腺和脾臟指數均顯著降低（P ＜0.05）.與衰老模型組相比，桑葉槲皮素低劑量和中劑量組的胸腺指數增加明顯（P ＜0.05），高劑量組和陽性對照組極顯著提高（P ＜0.01）；而桑葉槲皮素中、高劑量組的脾臟指數有所增加（P ＜0.05），低劑量組無明顯差異（P ＞0.05），陽性對照組升高明顯（P ＜0.01，見表1）.

表1 桑葉槲皮素對小鼠胸腺、脾臟指數的影響（n ＝10，±s）Tab. 1 Effects of MAQ on thymus and spleen indices in mice（n ＝10，±s）

表1 桑葉槲皮素對小鼠胸腺、脾臟指數的影響（n ＝10，±s）Tab. 1 Effects of MAQ on thymus and spleen indices in mice（n ＝10，±s）

注：與空白對照組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與衰老模型組相比*P ＜0.05，**P ＜0.01.

組別 胸腺指數 脾臟指數空白對照組（CG） 0.04 ±0.06 0.67 ±0.12衰老模型組（MG） 0.29 ±0.04 ## 0.46 ±0.09 #陽性對照組（PC） 0.39 ±0.05 ** 0.63±0.11**MAQ低劑量組（MAQ-L） 0.35 ±0.04 * 0.53 ±0.15 MAQ中劑量組（MAQ-M） 0.36 ±0.04 * 0.55 ±0.14 *MAQ高劑量組（MAQ-H） 0.36 ±0.06 ** 0.57 ±0.17*

2.2 桑葉槲皮素對小鼠血清中T -AOC、SOD 和MDA含量的影響 由表2 可知，與空白對照組相比，衰老模型組小鼠在D -半乳糖的作用下，血清的T -AOC、SOD 和GSH -Px 活性顯著降低（P ＜0.01），MDA含量升高（P ＜0.01）.在灌胃桑葉槲皮素后，與衰老模型組小鼠相比，桑葉槲皮素低劑量組GSH-Px活性有所提升（P ＜0.05），MDA 含量降低（P ＜0.05）；中、高劑量和陽性對照組小鼠血清的T-AOC、SOD和GSH-Px活性均有不同程度增加（P ＜0. 05），MDA 含量極顯著降低（P ＜0.01）.

2.3 V3 區16S rDNA PCR 擴增結果 小鼠腸道菌群如圖1 瓊脂糖凝膠電泳所示，特異性擴增產物片段長度在200 bp左右，與預期相符.

表2 桑葉槲皮素對小鼠血清中T-AOC、SOD、MDA和GSH-Px的影響（n ＝10，±s）Tab. 2 Effects of MAQ on T-AOC，SOD，MDA and GSH-Px in serum of mice（n ＝10，±s）

表2 桑葉槲皮素對小鼠血清中T-AOC、SOD、MDA和GSH-Px的影響（n ＝10，±s）Tab. 2 Effects of MAQ on T-AOC，SOD，MDA and GSH-Px in serum of mice（n ＝10，±s）

注：與空白對照組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與衰老模型組相比*P ＜0.05，**P ＜0.01.

組別 T-AOC水平／（U／mL） SOD活性／（U／mL） MDA含量／（nmol／mL） GSH-Px活性／（U／mL）空白對照組（CG） 16.38 ±2.11 119.75 ±4.99 6.61 ±1.22 16.52 ±0.87衰老模型組（MG） 6.73 ±1.20 ## 103.79 ±.5.35 ## 13.89 ±1.76 ## 9.23 ±0.65 ##陽性對照組（PC） 14.93 ±2.53 ** 117.54 ±4.21 ** 7.24 ±1.12 ** 14.64 ±0.66 **MAQ低劑量組（MAQ-L） 8.27 ±0.88 105.52 ±6.15 11.54 ±0.68 * 11.80 ±0.74 *MAQ中劑量組（MAQ-M） 10.32 ±0.43 * 108.17 ±4.49 * 9.51 ±1.01 ** 13.12 ±0.69 **MAQ高劑量組（MAQ-H） 12.43 ±1.65 ** 115.23 ±5.38 ** 8.35 ±1.18 ** 14.27 ±0.61**

2.4 腸道菌群的多樣性分析 灌胃治療第0 d，即8 周衰老模型完成時，與空白對照組相比，衰老模型組小鼠腸道菌群多樣性顯著降低（P ＜0.01），表明衰老可能會導致小鼠腸道菌群多樣性下降.與衰老模型組相比，陽性對照及治療組沒有差異（P ＞0.05）.灌胃治療第10 d，衰老模型組小鼠腸道菌群多樣性低于空白對照組和陽性對照組（P ＜0.05）.灌胃治療第30 d，與空白對照組相比，衰老模型組小鼠腸道菌群多樣性較低，但差異不顯著（P ＞0.05）；與衰老模型組相比，陽性對照組和桑葉槲皮素低劑量組小鼠腸道菌群多樣性有所增加，但差異不顯著（P ＞0.05），桑葉槲皮素中劑量組小鼠腸道菌群多樣性增加明顯（P ＜0.05），高劑量組小鼠腸道菌群多樣性有極顯著增加（P ＜0.01）.見圖2 ～3.

3 討論

根據衰老的代謝紊亂學說，在一定時間內連續注射D-半乳糖可導致細胞代謝紊亂，自由基氧化與抗氧化作用動態平衡失調，使個體細胞易受自由基的傷害，導致機體加速衰老［10］.本實驗中的衰老模型組小鼠在注射過D -半乳糖后，T -AOC 水平、GSH-Px和SOD活性顯著降低，MDA含量升高，證明D-半乳糖建立衰老模型成功.

圖1 小鼠腸道菌群16S rDNA的V3區PCR產物Fig. 1 16S rDNA PCR products of gut microbiota from different groups of mice

圖2 桑葉槲皮素對衰老小鼠腸道菌群多樣性指數的影響（n ＝5，±s）Fig. 2 Effects of MAQ on indices of gut microbiota diversity in aged mice（n ＝5，±s）

圖3 灌胃第30 d桑葉槲皮素對衰老小鼠腸道菌群多樣性的影響（n ＝5，±s）Fig. 3 Effects of MAQ on gut microbiota diversity of aged mice in 30 d（n ＝5，±s）

機體抗氧化能力的強弱與健康程度存在密切的關系，作為機體重要的免疫器官，胸腺和脾臟指數反應機體內淋巴細胞增殖程度，與免疫調節功能密切相關.T-AOC是對機體抗氧化能力的總體評價，抗氧化酶類能夠清除和分解體內過量的和H2O2等自由基，其中SOD就是重要的抗氧化酶之一，維持機體抗氧化動態平衡.GSH -Px 能通過阻斷氧化還原反應防止過氧化物對機體的損害.MDA是細胞膜脂質過氧化物，可反映出機體內脂質的過氧化程度，MDA含量的高低間接反映了機體受到自由基攻擊的嚴重程度［11-12］.

本研究與衰老模型組相比，桑葉槲皮素高劑量組T-AOC 水平、GSH -Px 和SOD 活性顯著升高，MDA含量顯著降低，與陽性對照組效果相似；中、低劑量組也能不同程度提高機體抗氧化能力.說明桑葉槲皮素具有清除體內自由基、增強機體抗氧化能力的作用.

現有研究表明，人和動物體內腸道菌群的狀態和宿主的健康密切相關.正常菌群可刺激機體免疫系統，拮抗許多致病菌的生長，清除體內有毒物質［13］.病理狀態下的腸道微生態受到破壞，而外源性的調節劑如益生菌能夠改善微生態環境，起到良好的預防和治療作用［14-15］.

本研究中，小鼠在接受D -半乳糖持續給藥建立衰老模型后，腸道菌群多樣性降低，表明體內腸道微生態紊亂.在桑葉槲皮素灌胃治療后，小鼠腸道菌群多樣性逐漸升高，證明桑葉槲皮素可能通過調節腸道菌群，增加菌群多樣性，從而改善機體的部分生理功能，起到延緩衰老的作用.

4 結論

本實驗研究表明，槲皮素可顯著提高衰老小鼠機體的總抗氧化能力T-AOC 水平，降低衰老小鼠脂質過氧化物MDA 含量，有效清除體內產生的過量自由基，具有明顯的抗氧化作用.同時腸道菌群多樣性研究表明，桑葉槲皮素灌胃后能明顯改善小鼠腸道菌群多樣性，改善機體生理功能，但抗氧化機制、腸道菌群多樣性的具體變化與桑葉槲皮素的構效關系仍然需要進一步的研究.

致謝 四川師范大學實驗技術與管理項目（SYJS2017028）對本文給予了資助，謹致謝意.