坤復(fù)康膠囊對盆腔炎性疾病后遺癥療效及紅細(xì)胞免疫、血漿TXB2、6-Keto-PGFlα的影響

張嘉曄， 耿紅玲， 許麗綿

（1.廣東省中醫(yī)院婦科，廣東廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，廣東廣州 510405）

盆腔炎性疾病后遺癥（chronic pelvic inflammatory disease，CPID）是常見的婦科臨床疾病之一，以下腹痛、腰酸、白帶異常等為主要表現(xiàn)，其癥狀遷延不愈者可發(fā)展為慢性盆腔痛、不孕癥、異位妊娠等嚴(yán)重影響婦女身心健康的疾病。西醫(yī)多采用抗生素、物理治療等，但對于慢性炎癥效果欠佳。中醫(yī)治療手段多種多樣，如中藥或中成藥內(nèi)服、中藥灌腸、針灸療法、穴位敷貼等，療效各異。本病以濕熱瘀結(jié)型多見[1]，故本研究采用具有活血化瘀、清熱利濕作用的坤復(fù)康膠囊治療CPID 患者，取得較好療效，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組收集2016年3月至2016年10 月于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的，明確診斷為濕熱瘀結(jié)型的CPID 患者，共70 例。采用隨機數(shù)字表將患者隨機分為觀察組和對照組，每組各35例。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) CPID 的診斷參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》（2002 版）[1]。（1）有急性盆腔炎病史。（2）癥狀:①腰骶部酸痛或下腹部墜痛；②經(jīng)期延長或月經(jīng)量多；③帶下量多，色白或黃或膿性，伴或不伴臭味；④低熱，乏力；⑤不孕。（3）體征:①子宮粘連固定或活動受限，伴或不伴壓痛；②一側(cè)或兩側(cè)附件區(qū)條索狀增粗，伴壓痛；③一側(cè)或兩側(cè)附件區(qū)可觸及囊性包塊，活動欠佳，伴或不伴壓痛；④一側(cè)或兩側(cè)附件區(qū)片狀增厚伴壓痛，或觸及宮骶韌帶增粗、變硬、觸痛。（4）輔助檢查:血分析、肝腎功能、B超等。凡具備上述第（2）項中的①和第（3）項中至少需同時具備“子宮粘連固定或活動受限，伴或不伴壓痛；附件區(qū)索狀或片狀增厚或包塊，伴或伴壓痛”，即可診斷為CPID。

1.2.1.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 濕熱瘀結(jié)型的辨證參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》（2002版）[1]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。（1）主癥:①下腹脹痛或刺痛，痛處固定；②腰骶脹痛；③帶下量多，色白或黃，質(zhì)稠。（2）次癥:①經(jīng)期腹痛加重；②月經(jīng)量多或經(jīng)期延長；③小便黃；④大便干燥或溏而不爽。（3）舌脈:舌質(zhì)暗紅或紅，或見舌邊或舌尖瘀點瘀斑，或舌底脈絡(luò)迂曲增粗，苔白或黃膩，脈弦滑或弦澀。判定標(biāo)準(zhǔn):具備主癥2 項、次癥3 項，結(jié)合舌脈即可辨證。

1. 2. 2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合上述CPID 診斷標(biāo)準(zhǔn)；②符合上述濕熱瘀結(jié)型的辨證標(biāo)準(zhǔn)；③年齡為20～50 歲；④自愿參加本試驗并簽署知情同意書的患者。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者；②合并多囊卵巢綜合征（PCOS）、子宮內(nèi)膜異位癥等其他婦科疾病的患者；③合并心腦血管、肝、腎及造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病的患者；④精神病患者；⑤未按規(guī)定用藥或資料不全，導(dǎo)致無法判斷療效及安全性的患者；⑥對本試驗方案所用藥物過敏的患者。

1.3 治療方法

1. 3. 1 觀察組 給予口服坤復(fù)康膠囊治療。用法:坤復(fù)康膠囊（陜西康惠制藥股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z20025834），口服，每次3粒，每日3次。

1.3.2 對照組 給予口服花紅片治療。用法:花紅片（廣西壯族自治區(qū)花紅藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z45020922），口服，每次4粒，每日3次。

1.3.3 療程 2 組均以20 d 為1 個療程，治療2 個療程，經(jīng)期停藥。

1.4 療效性指標(biāo)觀察參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》（2002 版）[1]。（1）中醫(yī)證候評分:根據(jù)中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)，主癥按無、輕、中、重分別計0、2、4、6 分，次癥按無、輕、中、重分別計0、1、2、3 分。（2）CPID 局部體征評分標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)體征，①項按程度不同分別計0、2、4、6 分，②③④項按程度不同分別計0、1、2、3、4、5、6分。

1.5 實驗指標(biāo)觀察

1.5.1 動物與試劑 豚鼠（250～350 g，普通級雌性）；健康人O 型紅細(xì)胞；高活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（浙江都邦藥業(yè)股份有限公司）；25%戊二醛溶液（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；快速瑞姬氏染液（南京建成科技有限公司）。血栓素B2（TXB2）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海藍(lán)基生物公司，編號:E01T0025）；6-酮前列腺素Flα（6-Keto-PGF1α）ELISA試劑盒（上海藍(lán)基生物公司，編號:E01A0682）。

1.5.2 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.2.1 紅細(xì)胞免疫檢測 （1）豚鼠血清的制備:采用腹主動脈采血法，以3 000 r/min 離心10 min，取上清液，放置于-80 ℃冰箱保存。（2）酵母菌的制備:生理鹽水50 mL+酵母菌50 mg，100 ℃水浴煮30 min，冷卻后以2 000 r/min 離心10 min，棄上清液。加入生理鹽水2 mL 配成濃度為5×108個/mL。①致敏酵母菌溶液:取上述溶液0.5 mL + 豚鼠血清0.5 mL，置于37 ℃水浴30 min，加入生理鹽水2 mL，混勻，以2 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加入生理鹽水2 mL。②未致敏酵母菌溶液:取上述溶液0.5 mL+生理鹽水2 mL。（3）紅細(xì)胞的制備:患者紅細(xì)胞懸液0.5 mL+ 生理鹽水2 mL，以2 000 r/min 離心洗滌5 min，共3 次，收集紅細(xì)胞。根據(jù)血常規(guī)中紅細(xì)胞計數(shù)，配成1.25×107/mL備用。（4）制片:①取兩管（A、B）分別加制備紅細(xì)胞75 μL，A管+致敏酵母溶液75 μL，B管+未致敏酵母溶液75 μL，搖勻后放置于37 ℃水浴30 min，再加入生理鹽水150 μL，混勻。②兩管均加50 μL 0.25%戊二醛，輕輕混勻；取100 μL 涂片、吹干；先用瑞姬氏染液試劑染色，經(jīng)清水沖洗后成片。③高倍顯微鏡計數(shù):2 個或以上酵母菌結(jié)于1 個紅細(xì)胞上為1 朵花環(huán)。計數(shù)200 個紅細(xì)胞，算出百分率。A 管為紅細(xì)胞C3b 受體花環(huán)率（erythrocyte C3b receptor rosette rate，E-C3bRR），B管為紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率（erythrocyte immune complex rosette rate，E-ICR）[3-5]。

1. 5. 2. 2 TXB2和6-Keto-PGFlα檢測 （1）樣品收集:患者血樣品以2 000 r/min離心20 min，收集血漿放于-80 ℃冰箱保存。（2）試劑盒檢測:①試劑盒置于20 ℃～25 ℃放置30 min；②取出酶標(biāo)板，按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別于空白孔中加入100 μL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；③于空白對照孔中加入100 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS）和100 μL 樣品；④空白對照孔除外，每孔加入酶標(biāo)記溶液50 μL；⑤密封酶標(biāo)板，孵育1 h（37 ℃恒溫、恒濕）；⑥清洗酶標(biāo)板；⑦拍干酶標(biāo)板；⑧分別加入顯色劑A 50 μL、B 50 μL；⑨避光反應(yīng)10～15 min；⑩加入50 μL 終止液；○1用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組內(nèi)治療前后比較采用配對樣本t 檢驗，組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗。計數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，當(dāng)n ≥40 且所有理論頻數(shù)T ≥5 時用卡方檢驗；當(dāng)n ≥40且存在理論頻數(shù)1 ≤T＜5時，由校正公式算出χ2值；當(dāng)n＜40 且存在理論頻數(shù)T ＜1，或20%以上理論頻數(shù)1 ≤T＜5，采用Fisher 確切概率法；有序資料采用秩和檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)性分析方法。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 2 組患者脫落情況及基線資料比較觀察過程中，2 組各有3 例患者脫落，最終2 組各有32 例患者完成試驗。觀察組年齡最小20歲，最大45歲，平均（31.03 ± 6.55）歲；對照組年齡最小20 歲，最大49 歲，平均（33.38 ± 7.71）歲。2 組患者年齡、病程、生育史、上環(huán)史、過敏史、治療史等基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。結(jié)果見表1～表3。

表1 2組患者年齡分布情況比較Table 1 Distribution of age groups in the two groups [n/例（p/%）]

表2 2組患者病程分布情況比較Table 2 Comparison of the course of disease in the two groups[n/例（p/%）]

2.2 2 組患者治療前后中醫(yī)證候評分及CPID 局部體征評分比較表4 結(jié)果顯示:治療前，2 組患者的中醫(yī)證候評分及CPID 局部體征評分比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，2 組患者的中醫(yī)證候評分及CPID 局部體征評分均較治療前明顯降低（P＜0.05），且觀察組的降低作用均明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 2組患者的生育史、上環(huán)史、過敏史和治療史比較Table 3 Comparison of baseline data in the two groups [n/例（p/%）]

表4 2組患者治療前后中醫(yī)證候評分及CPID局部體征評分比較Table 4 Comparison of the scores of TCM syndrome and focal signs of CPID in the two groups before and after treatment（±s，s/分）

表4 2組患者治療前后中醫(yī)證候評分及CPID局部體征評分比較Table 4 Comparison of the scores of TCM syndrome and focal signs of CPID in the two groups before and after treatment（±s，s/分）

統(tǒng)計方法:t 檢驗；①P＜0.05，與治療前比較；②P＜0.05，與對照組治療后比較

組別觀察組對照組N/例32 32中醫(yī)證候評分治療前9.03±1.89 8.72±1.75治療后0.75±0.84①②1.47±1.44①CPID局部體征評分治療前6.41±2.67 6.03±2.71治療后0.59±0.76①②2.50±2.06①

2. 3 2 組患者治療前后E-C3bRR、E-ICR 水平比較表5結(jié)果顯示:治療前，2組患者的E-C3bRR、E-ICR 水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，2組患者的E-C3bRR 水平均明顯升高、EICR 水平均明顯降低（P＜0.05），且觀察組對EC3bRR 水平的升高作用及對E-ICR 水平的降低作用均明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 ）。

表5 2組患者治療前后E-C3bRR、E-ICR水平比較Table 5 Comparison of the levels of E-C3bRR and E-ICR in the two groups before and after treatment（±s，p/%）

表5 2組患者治療前后E-C3bRR、E-ICR水平比較Table 5 Comparison of the levels of E-C3bRR and E-ICR in the two groups before and after treatment（±s，p/%）

統(tǒng)計方法:t 檢驗；①P＜0.05，與治療前比較；②P＜0.05，與對照組治療后比較

組別觀察組對照組N/例32 32 E-C3bRR治療前12.40±5.52 11.91±5.65治療后20.51±6.75①②16.70±4.66①E-ICR治療前15.41±6.97 15.18±6.68治療后9.90±4.68①②12.43±4.70①

2. 4 2 組 患 者 治 療 前 后 血 漿TXB2、6-Keto-PGFlα水平比較表6 結(jié)果顯示:治療前，2 組患者的血漿TXB2、6-Keto-PGFlα水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，觀察組的TXB2水平明顯降低，6-Keto-PGFlα水平明顯升高（P＜0.05），而對照組僅TXB2水平降低（P＜0.05）。組間比較，觀察組對TXB2水平的降低作用明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表6 2組患者治療前后血漿TXB2、6-Keto-PGFlα水平比較Table 6 Comparison of the plasma levels of TXB2 and 6-Keto-PGFlα in the two groups before and after treatment (±s)

表6 2組患者治療前后血漿TXB2、6-Keto-PGFlα水平比較Table 6 Comparison of the plasma levels of TXB2 and 6-Keto-PGFlα in the two groups before and after treatment (±s)

統(tǒng)計方法:t 檢驗；①P＜0.05，與治療前比較；②P＜0.05，與對照組治療后比較

組別觀察組對照組N/例32 32 TXB2[ρ/（pg·mL-1）]治療前0.58±0.07 0.59±0.09治療后0.46±0.10①②0.51±0.10①6-Keto-PGFlα[ρ/（ng·mL-1）]治療前0.76±0.15 0.80±0.11治療后0.86±0.21①0.81±0.12

2. 5 E-C3bRR 與血管因子相關(guān)性分析表7 結(jié)果顯示:經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析，E-C3bRR 與TXB2存在負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.21，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表7 E-C3bRR與血管因子相關(guān)性分析Table 7 Correlation of E-C3bRR with the vascular factors

3 討論

坤復(fù)康膠囊由烏藥、赤芍、劉寄奴、萆薢、香附、豬苓、萹蓄、苦參、女貞子等組成，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抑菌、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、改善血液循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫功能等作用。花紅片是《中成藥臨床應(yīng)用指南》[6]中作為盆腔炎性疾病后遺癥（CPID）中濕熱瘀阻型的推薦藥物，同時是2012 年《國家基本藥物目錄》[7]婦科清熱劑中含祛瘀止痛功效藥物。花紅片由白花蛇舌草、地桃花、雞血藤、一點紅、白背葉根、菥冥、桃金娘根等組成。兩者均有活血化瘀、清熱利濕作用。比較兩者治療作用，前者偏重“活血化瘀”，后者偏重“清熱解毒”。本研究結(jié)果提示，坤復(fù)康膠囊與花紅片對于濕熱瘀結(jié)型CPID 患者均有較好的療效，而前者療效優(yōu)于后者。

紅細(xì)胞CR1（complement receptor 1/C3bR/C4bR）是紅細(xì)胞免疫的重要基礎(chǔ)，為紅細(xì)胞C3b/C4b的受體。紅細(xì)胞CR1 具有以下幾方面作用:（1）免疫復(fù)合物（immune complexes，IC）過多地與C3b結(jié)合會抑制免疫功能，而CR1 可促進IC 在循環(huán)中的清除；（2）增強吞噬細(xì)胞對病原微生物的吞噬作用；（3）抑制補體活化等生物學(xué)功能作用。在一般實驗條件下，免疫黏附是紅細(xì)胞天然免疫能力最易呈現(xiàn)的現(xiàn)象，即紅細(xì)胞CR1 活性強弱也可通過這一現(xiàn)象的強弱呈現(xiàn)。與補體致敏酵母菌黏附形成的花環(huán)（E-C3bR）數(shù)量代表紅細(xì)胞CR1 活性；而與未致敏的酵母菌形成的花環(huán)（E-IC 花環(huán)）代表紅細(xì)胞膜上被IC 黏附的C3b分子量[8]。在本課題組前期動物實驗中，CPID 模型大鼠與正常組大鼠比較，EC3bRR 降低，E-ICR 增高，紅細(xì)胞免疫功能處于低下狀態(tài)；各復(fù)坤康膠囊治療組（高、中、低劑量組）的E-C3bRR 與模型組比較明顯增高，而高劑量組的E-ICR與模型組比較明顯降低[9]。

在正常人體，體內(nèi)凝血、抗凝血、纖溶系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，相互制約；血瘀形成后，血液運行受阻，血流不暢，血液凝滯，內(nèi)外源凝血途徑均被激活，血小板黏附聚集。而血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）主要來源于血小板，可促進血小板聚集和黏附，也有較強的收縮血管能力，是一種致血栓形成效應(yīng)較強的物質(zhì)。前列環(huán)素（prostacyclin，PGI2）主要靠血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，其作用與TXA2相反，除抑制除血小板聚集和黏附外，也可舒張血管[10]。TXA2、PGI2間的平衡與否與微血管口徑的改變有密切聯(lián)系[11]。一般情況下TXA2和PGI2處于動態(tài)平衡狀態(tài)，故TXA2和PGI2常在中醫(yī)藥研究中被作為活血化瘀藥物療效的客觀標(biāo)準(zhǔn)[12-14]。盆腔的組織器官有著靜脈的血流慢、數(shù)量多、靜脈組織薄弱的血循環(huán)特點。當(dāng)病原體等攻擊機體，機體產(chǎn)生應(yīng)激性反應(yīng)，出現(xiàn)血管損傷，內(nèi)皮細(xì)胞受損，使原有的平衡失調(diào)，引起血管收縮、血小板聚集，進而引發(fā)血栓形成，血液黏稠度增加，血管阻力增大，使盆腔出現(xiàn)缺血缺氧情況。然而兩者在血液中并不穩(wěn)定，但可分別轉(zhuǎn)化為 較 穩(wěn) 定 的 代 謝 產(chǎn) 物TXB2、6-Keto-PGFlα[15]。TXA2、PGI2水平可以通過檢測TXB2、6-Keto-PGFlα了解。劉虹等[16-17]的動物實驗中，CPID 模型大鼠的TXB2、6-Keto-PGFlα與正常大鼠比較，處于失衡狀態(tài)，通過灌胃活血化瘀、清熱化濕中藥后，TXB2含量下降，6-Keto-PGFlα含量提高，使得TXB2/6-Keto-PGFlα比值趨于平衡。

當(dāng)紅細(xì)胞CR1 對凝血酶、纖維蛋白酶等敏感性較高時，易被此類酶破壞。機體處于血瘀狀態(tài)時，此類酶增多，使紅細(xì)胞CR1 活性降低；且因血液循環(huán)障礙，使IC 蓄積增多，紅細(xì)胞黏附IC 過多，CR1 空位減少，進一步降低紅細(xì)胞CR1 活性，如此形成惡性循環(huán)[8]。本研究結(jié)果顯示TXB2與EC3bRR 存在負(fù)相關(guān)，說明該證型的CPID 患者紅細(xì)胞CR1 活性越好，血漿中TXB2含量越低，考慮可能與紅細(xì)胞CR1 活性越好，對IC 清除能力越強，使免疫能力提高，以及有效減輕炎癥反應(yīng)、減少氧化應(yīng)激等有關(guān)[18]。吳兆增等[19]研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓患者的外周血中TXB2與紅細(xì)胞免疫功能存在相關(guān)性，其研究結(jié)果與本研究結(jié)果相近。

本研究結(jié)果提示，坤復(fù)康膠囊可有效改善濕熱瘀結(jié)型CPID 患者紅細(xì)胞免疫，提高患者的血管因子水平，其作用優(yōu)于花紅片，考慮可能與坤復(fù)康膠囊的“活血化瘀”之力更強有關(guān)。本研究結(jié)果還提示，紅細(xì)胞免疫及TXA2、PGI2水平在CPID的機制研究中具有重要的理論及應(yīng)用價值，可作為中醫(yī)藥“活血化瘀”作用機制的觀察指標(biāo)。