白藜蘆醇對TNF-α誘導的人支氣管上皮細胞炎癥反應的干預作用

高韻， 吳東， 陳子瑜， 陳翠芬， 吳斌

（廣東醫科大學附屬醫院，廣東湛江 524001）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是慢性炎癥性氣道疾病，是全球發病率和病死率上升最快的疾病之一[1]。目前，吸入糖皮質激素是治療哮喘的主要方案，但效果尚不令人滿意[2]。因此，尋求哮喘的治療藥物仍是基礎和臨床研究中的熱點。中藥虎杖性微寒、味微苦，歸肝、膽、肺經，能利濕退黃、清熱解毒、止咳化痰[3]，其在臨床可治療呼吸道感染、肺動脈高壓等呼吸系統疾病[4]。白藜蘆醇是虎杖的主要活性成分[5]，具有抗炎[6]、抗腫瘤[7]、抗衰老[8]等作用。腫瘤壞死因子α（TNF-α）是哮喘發作的重要誘因之一，它能在氣道上皮細胞、肺成纖維細胞、 中性粒細胞、血管內皮細胞中誘導一系列炎癥介質的瀑布樣連鎖反應，導致支氣管痙攣，血管通透性增加，誘發和加重哮喘反應[9]。本研究旨在觀察白藜蘆醇對TNF-α 誘導的人支氣管上皮細胞炎癥反應的干預作用，并探討其可能的作用機制，以拓展中藥提取物白藜蘆醇的應用價值，也為臨床應用白藜蘆醇治療哮喘奠定基礎，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養人支氣管上皮細胞株16-HBE獲自中科院上海細胞庫。以含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基于37 ℃、體積分數5%CO2條件下培養。

1. 2 藥物、試劑與儀器白藜蘆醇（批號:R5010100112K5216）、TNF-α（美國Sigma 公司）。細胞計數試劑盒8（CCK-8）（日本同仁化學研究所）；Perfect Real Time 染料法實時熒光定量試劑盒、逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）；引物購自上海生工生物工程有限公司；核轉錄因子κB 抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化核轉錄因子κB 抑制蛋白α（p-IκBα）、核轉錄因子κB p65（NF-κB p65）、磷酸化核轉錄因子κB p65（p-NF-κB p65）等兔抗（美國CST 生物公司）。全波長酶標儀（美國Thermo Scientific 公司）；實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（瑞士Roche 公司）；蛋白免疫印跡（Western Blot）轉印儀（美國Bio-Rad公司）；增強型化學發光反應試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.3 CCK-8法測定16-HBE細胞存活率將16-HBE細胞以5 × 106個/孔接種在96 孔板，以0、50、100、150、200 μmol/L 的 白 藜 蘆 醇 分 別 處 理16-HBE細胞24 h。加入10 mL CCK-8 液37 ℃孵育1 h。應用酶標儀于450 nm波長處測量吸光度（OD，D）值。

1. 4 實時定量PCR 法檢測16-HBE 細胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 表達水平以0、0.5、5、10 ng/mL TNF-α[10]刺激16-HBE 細胞24 h，或以10 ng/mL TNF-α刺激16-HBE細胞3、6、18、24 h，采用實時熒光定量PCR 法檢測16-HBE 細胞中MMP-9、IL-1β、IL-6 mRNA 表達水平。50、100、150 μmol/L 白藜蘆醇作用于16-HBE 細胞1 h，再用TNF-α 刺激23 h 后，采用實時熒光定量PCR 法檢測16-HBE 細胞中MMP-9、IL-1β、IL-6 mRNA表達水平。操作步驟:裂解細胞提取總RNA， 經氯仿、異丙醇、乙醇洗滌處理后，應用分光光度計定量D（260 nm）與D（280 nm）。分別取1 μg 總RNA，通過逆轉錄一步法，獲得cDNA 產物，進行PCR 反應。引物序列:IL-6 正義鏈，5’-CCTGAA CCTTCCAAAGATGGC-3’；IL-6 反義鏈，5’-TTC ACCAGGCAAGTCTCCTCA-3’；擴展片段長度75 bp。MMP9 正 義 鏈，5’-TGCATAAGGACGACGTGAAT GGC-3’；MMP9 反義鏈，5’-CTGCGGTGTGGTGG TGGTTG-3’；擴展片段長度89 bp。IL-1β 正義鏈，5’-TTAAAGCCCGCCTGACAGA-3’；IL-1β 反義鏈，5’-GCGAATGACAGAGGGTTTCTTAG-3’；擴展片段長度62 bp。熱循環條件:95 ℃2 min，40 個95 ℃循環10 s，60 ℃循環30 s。用2-△△Ct相對定量方法分析檢測結果，并以內參基因GAPDH 對檢測結果進行歸一化處理。

1. 5 Western Blot 法 檢 測16-HBE 細 胞IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白的表達以50、100、150 μmol/L 白藜蘆醇分別處理16-HBE 細 胞1 h，再 用TNF-α 刺 激23 h 后，采 用Western Blot法檢測16-HBE細胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白的表達水平。操作步驟:取樣本蛋白定量40 μg 煮沸5 min，通過十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，轉至0.22 μm 聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。新鮮配制的含0.5%Tween20 的TBS 中加入50 g/L脫脂奶粉進行封閉， 室溫封閉1 h。分別加入兔抗IκBα 抗體（1∶1 000）、兔抗p-IκBα 抗體（1∶1 000）、兔抗NF-κB p65 抗體（1∶1 000）、兔抗p-NF-κB p65 抗體（1∶1 000）、兔抗GAPDH 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。洗膜3 次，加1∶2 000稀釋的生物素標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h。用TBST 洗膜3 遍，上機掃描圖像、拍照。使用Image J 1.43 軟件對蛋白條帶灰度進行定量，結果以目的蛋白與內參蛋白的灰度值比值（p）表示。

1. 6 統計方法采用GraphPad Prism 7 軟件進行數據分析。實驗數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用Student t 檢驗法。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 不同濃度白藜蘆醇對16-HBE 細胞活力的影響圖1 結果顯示，與0 μmol/L 白藜蘆醇組比較，50、100、150、200 μmol/L 白藜蘆醇組細胞存活率無明顯變化（P ＞0.05）。提示白藜蘆醇在0 ～200 μmol/L劑量范圍內沒有導致細胞活力下降，該濃度范圍可用于后續細胞研究。

2. 2 TNF-α 對16-HBE 細 胞 中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA表達的影響圖2結果顯示:與0 ng/mL TNF-α 組比較，0.5、5、10 ng/mL TNF-α 刺激16-HBE 細胞24 h 后IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA表達水平增高，且具有濃度依賴性，其中，10 ng/mL TNF-α 最為明顯，差異有統計學意義（P ＜0.01 或P ＜0.001）；與作用3 h 組比較，10 ng/mL TNF-α刺激16-HBE 細胞6、18、24 h 后IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 表達水平增高，且具有時間依賴性，其中，24 h 作用最為明顯，差異有統計學意義（P ＜0.01或P ＜0.001）。

圖1 不同濃度白藜蘆醇對16-HBE細胞活力的影響(±s)Figure 1 The effects of different concentrations of resveratrol on vability of 16-HBE cells(±s)

2. 3 白藜蘆醇對TNF-α 誘導的16-HBE 細胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 表達的影響圖3 結果顯示:與TNF-α 誘導組比較，50、100、150 μmol/L 白藜蘆醇組16-HBE 細胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 表達水平均降低，差異有統計學意義（P ＜0.001），且呈劑量依賴性。

2. 4 白藜蘆醇對TNF-α 誘導的16-HBE 細胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達的影響圖4 結果顯示:與TNF-α 誘導組比較，50、100、150 μmol/L 白藜蘆醇組TNF-α 誘導的16-HBE 細胞中p-IκBα 蛋白表達水平增高，且呈劑量依賴性，其中，100、150 μmol/L 白藜蘆醇組差異有統計學意義（P ＜0.01 或P ＜0.001），而p-NF-κB p65 蛋白表達水平均降低，差異有統計學意義（P ＜0.001）。

3 討論

目前，建議以吸入性糖皮質激素為基石的階梯式規范治療哮喘[11]，但其只能使78%的哮喘患者達到臨床控制，而且需要長時間治療，并伴有一系列副作用[12]。盡管多種藥物聯合使用但仍不能獲得很好的療效，嚴重影響了患者的生活質量，并帶來極大的家庭和社會負擔，因此，迫切需求開發更安全有效的治療藥物。

圖2 TNF-α對16-HBE細胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA表達的影響(±s)Figure 2 The effects of TNF-α on mRNA expression levels of IL-6，MMP-9，IL-1β in 16-HBE cells(±s)

圖3 白藜蘆醇對TNF-α誘導的16-HBE細胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA表達的影響(±s)Figure 3 The effects of resveratrol on the mRNA expression levels of IL-6，MMP-9 and IL-1β in TNF-α-induced 16-HBE cells(±s)

圖4 白藜蘆醇對TNF-α誘導的16-HBE細胞中IκBα、NF-κB p65 磷酸化的影響(±s)Figure 4 The effects of resveratrol on phosphorylation of IκBα、NF-κB p65 in TNF-α-induced 16-HBE cells(±s)

哮喘是以氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應為主要特征的肺部慢性疾病。有調查指出91%哮喘主要是由小氣道炎癥引起的[13]。有研究表明，IL-6 能調節樹突狀細胞攝取過敏原、促進Th2/Th17 介導的氣道炎癥[14]。IL-1β 參與炎癥小體活化，作為活動性過敏性疾病（如哮喘）的生物標志物[15]。MMP-9 由支氣管上皮細胞、肺泡上皮和許多炎癥細胞產生，能募集炎癥細胞和產生炎性介質[16]。故IL-6、IL-1β、MMP-9等炎癥相關因子在哮喘氣道炎癥中起著至關重要的作用。白藜蘆醇是一種藥效學多樣的多酚類中藥提取物，具有改善細胞代謝、抗炎等生物效應。本研究結果顯示:TNF-α能刺激人支氣管上皮細胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 過表達，24 h 時最為明顯（P＜0.05）。而經過白藜蘆醇干預后，TNF-α刺激的人支氣管上皮細胞產生的IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 表達降低（P＜0.05），表明白藜蘆醇可抑制TNF-α 刺激的人支氣管上皮細胞炎癥反應。

已知NF-κB 蛋白信號傳導途徑在支氣管哮喘發病機制中被激活，參與了炎癥反應的調控，其活化需要IκB 激酶的解離以及NF-κB 的核移位等2 個條件[17]。白藜蘆醇可通過調控NF-κB通路起到調節炎癥的作用[18-19]。本研究結果顯示，TNF-α可促進16-HBE 細胞中IκBα的降解和NF-κB的活化，而白藜蘆醇可抑制TNF-α 誘導的16-HBE 細胞IκBα 的降解和NF-κB 的激活，表明白藜蘆醇可能通過阻止NF-κB活化來減輕炎癥反應。

綜上所述，白藜蘆醇可抑制TNF-α 誘導人支氣管上皮細胞的炎癥反應，其機制可能與抑制NFκB的激活有關。