鳶尾黃素對大鼠糖尿病腎病的治療作用

李惠， 劉建林， 牛聰， 張威， 王慧超

（河南大學第一附屬醫院腎內科，河南開封 475000）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是終末期腎衰竭的主要原因[1]，占全世界需要透析治療的所有病例的35% ～40%。據世界衛生組織估計，全球有4.15 億成年人患有糖尿病，到2040 年將增加到6.42 億[2]。糖尿病發病率的上升使DN 成為當前最重要的公共衛生問題之一[3]，迫切需要開發新的療法來改善DN 治療。目前，許多植物藥被用作DN 的補充療法。中藥鳶尾科植物射干及鳶尾具有清熱解毒、利咽消痰、散血消腫的功效[4]，我國資源豐富。研究發現，射干和鳶尾的活性成分鳶尾黃素是一種天然異黃酮，結構圖如圖1所示。已有研究表明，鳶尾黃素具有抗增殖，抗炎，抗氧化[5-7]，抑制醛糖還原酶、皮質胰島素抵抗[7-8]，有降血糖、降血脂[9-10]等廣泛藥理學作用。基于此，本研究旨在探討鳶尾黃素對大鼠DN 的治療作用，現將研究結果報道如下。

圖1 鳶尾黃素結構式Figure 1 Chemical structure of tectorigenin

1 材料與方法

1.1 實驗動物48只5周齡雄性SD大鼠，體質量（110±5）g，購自浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，許可證號:SYXK（浙）2018-0012。于河南大學醫學院實驗動物中心飼養，溫控（22±1）℃，光控（200 lux，12 h 光暗循環），許可證號:SYXK（豫）2016-0006。

1. 2 主要藥物與試劑鳶尾黃素（化學式:C16H12O6；分子量:300.26；批號:67356），美國Sigma-Aldrich 公司生產。鹽酸二甲雙胍，購自中國食品藥品檢定研究院，批號:100664-201805。鏈脲佐菌素，購自美國Sigma-Aldrich 公司；蘇木素—伊紅染液，尿蛋白（UP）、血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）等測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素1β（IL-1β）等酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒，cleaved caspase-3 抗體，核轉錄因子κB p65（NF-κB p65）抗體，磷酸化NF-κB p65（P-NF-κB p65）抗 體、GAPDH 抗 體 購 自 美 國Abcam公司。

1.3 主要儀器2404948 血糖儀（羅氏血糖健康醫護公司）；AU5800 全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；318C+酶標儀（中國上海沛歐分析儀器有限公司）；723S 分光光度計（中國上海棱光技術有限公司）；DS360 全自動糖化血紅蛋白檢測分析儀（美國Drew Scientific公司）。

1.4 分組、動物模型建立與給藥將48只大鼠常規飼養7 d 后隨機分為4 組，即正常組、模型組、二甲雙胍組、鳶尾黃素組，每組12 只。造模[11]與給藥方法:除正常組，其他3組大鼠給予高糖高脂飼料（質量分數配方為20%蔗糖、12%豬油、5%奶粉、2%雞蛋和61%正常飼料）喂養3周后，一次性腹腔注射35 mg/kg 鏈脲佐菌素，構建DN 大鼠模型。造模期間，正常組大鼠正常飲食。模型建立1周后，檢測大鼠血糖值，若血糖大于300 mg/dL即可判斷造模成功[12]。判斷造模成功后，開始給藥。二甲雙胍組大鼠給予腹腔注射二甲雙胍（劑量為10 mg·kg-1·d-1），鳶尾黃素組大鼠給予腹腔注射鳶尾黃素（劑量為300 mg·kg-1·d-1），正常組大鼠給予腹腔注射生理鹽水。共8周。給藥期間，正常組大鼠繼續正常飲食，其他組別大鼠繼續給予高糖高脂飼料。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 腎質量/體質量指數 給藥結束后，稱量大鼠質量。處死大鼠，采集腎臟組織進行稱量。計算腎質量/體質量指數。

1.5.2 血糖、糖化血紅蛋白 采用血糖儀檢測大鼠血糖值，全自動糖化血紅蛋白檢測分析儀檢測大鼠糖化血紅蛋白含量。

1. 5. 3 腎功能指標 按照試劑盒說明書操作步驟，采用可見分光光度計測定大鼠24hUP、SCr、BUN 水平。在595 nm 波長處測定24hUP吸光度值，在546 nm 波長處測SCr 吸光度值，在640 nm 波長處測定BUN吸光度值。

1. 5. 4 血脂指標 按照試劑盒說明書操作步驟，采用可見分光光度計測定大鼠血脂指標TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平。在546 nm 波長處測定LDL-C、HDL-C 吸光度值，在510 nm 波長處測定TC、TG吸光度值。

1.5.5 氧化應激指標 按照試劑盒說明書步驟操作。采用酶標儀測定SOD 活性，在450 nm 波長處測定SOD 吸光度值；采用可見分光光度計測定CAT、GSH 活性及MDA 含量，在405 nm 波長處測CAT吸光度值，在420 nm波長處測GSH吸光度值，在532 nm波長處測MDA吸光度值。

1. 5. 6 血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平 采用ELISA 法。在4 ℃下用50 mmol/L 的碳酸鹽包被緩沖液溶解抗原，100 μL/孔（96 孔酶標板）。將抗原包被過夜，棄去包被液，用磷酸鹽—Tween-20 磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌3 次，每次5 min。每孔加150 μL 體積分數1%胎牛血清白蛋白（BSA）封閉1 h，PBST 洗滌3 次，加入100 μL 不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37 ℃孵育2 h，PBST洗滌5 次。加入100 μL 稀釋后的HRP 標記的二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5次后以顯色劑顯色20 min，用酶標儀在450 nm波長處測吸光度值。

1. 5. 7 腎組織病理變化 采用HE 染色法。將新鮮腎組織用體積分數10%福爾馬林固定，進行石蠟包埋，切片脫蠟，蒸餾水潤濕組織，蘇木素核染色5 min，水洗5 s，伊紅漿染色30 s，水洗后，濾紙吸干，無水乙醇脫水2次后封片。在熒光顯微鏡下觀察腎組織病理表現。

1. 5. 8 腎組織cleaved caspase-3 蛋白表達 采用免疫組織化學法。將腎組織切片先脫蠟處理后用PBST 沖洗2 次，40 g/L 多聚甲醛固定30 min，體積分數3%過氧化氫阻斷內源性過氫化物酶活性，用體積分數10%正常山羊血清在TBS 中孵育30 min。然后用抗cleaved caspase-3 抗體孵育過夜。次日用PBS 沖洗3 次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶（HRP）二抗孵育30 min，室溫下用DBS顯色。熒光顯微鏡下觀察。

1. 5. 9 腎組織P-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達 采用Western Blot 法。取大鼠腎組織加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，以12 000 r/min 離心10 min，進行總蛋白提取，用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒測定蛋白質含量。提取等量的蛋白質樣品20 mg，在100 ℃條件下變性5 min。然后進行十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白并轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，分別加入P-NF-κB p65、NF-κB p65 抗體（1 000 倍稀釋）4 ℃孵育過夜，清洗，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，孵育2 h，最后加入電化學發光（ECL）液，曝光處理。應用Image J 軟件測量蛋白條帶灰度值。

1.6 統計方法采用統計軟件SPSS 18.0對數據進行分析。實驗結果均以均數±標準差(±s)表示。先對實驗數據進行正態分布分析和方差齊性分析，符合條件的選用單因素方差分析或t 檢驗，不符合條件的選用秩和檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎質量/體質量指數、血糖值、糖化血紅蛋白水平比較圖2結果顯示:模型組大鼠腎質量/體質量指數，血糖值、糖化血紅蛋白水平顯著高于正常組（P＜0.01）；二甲雙胍組、鳶尾黃素組大鼠腎質量/體質量指數、血糖值、糖化血紅蛋白水平顯著低于模型組（P＜0.01），且2 個治療組腎質量/體質量指數、血糖值、糖化血紅蛋白水平比較，差異均無統計學意義（P ＞0.05）。

2.2 各組大鼠BUN、SCr、24hUP 水平比較表1結果顯示:模型組大鼠BUN、SCr、24hUP 水平顯著高于正常組（P＜0.01）；二甲雙胍組、鳶尾黃素組大鼠BUN、SCr、24hUP 水平顯著低于模型組（P＜0.01），且2 個治療組BUN、SCr、24hUP 水平比較，差異均無統計學意義（P ＞0.05）。

圖2 各組大鼠腎質量/體質量指數、血糖值、糖化血紅蛋白（HBA1C）水平比較（±s，N=12只）Figure 2 Comparison of renal mass/body mass index，blood glucose value，and glycosylated hemoglobin levels in various groups（±s，N=12）

表1 各組大鼠BUN、SCr、24hUP水平比較Table 1 Comparison of the levels of BUN，SCr，and 24hUP in various groups (±s)

表1 各組大鼠BUN、SCr、24hUP水平比較Table 1 Comparison of the levels of BUN，SCr，and 24hUP in various groups (±s)

①P ＜0.01，與正常組比較；②P ＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組二甲雙胍組鳶尾黃素組N/只12 12 12 12 BUN[（c/mmol?L-1）]5.68±0.89 12.54±1.10①6.54±0.75②7.64±0.97②SCr[c/（μmol?L-1）]88.82±10.35 143.57±20.54①103.32±13.88②110.21±15.39②24hUP[b/（mg?kg-1）]20.31±6.12 186.54±30.25①103.41±21.11②76.87±17.12②

2. 3 各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平比較表2結果顯示:與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組、鳶尾黃素組大鼠血清TC、TG、LDL-C 水平顯著降低，HDL-C 水平顯著升高（均P＜0.01），且2 個治療組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。

表2 各組大鼠血清TC、TG、 LDL-C、HDL-C水平比較Table 2 Comparison of the levels of serum TC，TG，LDL-C and HDL-C in various groups[±s，c/（mmol·L-1）]

表2 各組大鼠血清TC、TG、 LDL-C、HDL-C水平比較Table 2 Comparison of the levels of serum TC，TG，LDL-C and HDL-C in various groups[±s，c/（mmol·L-1）]

①P ＜0.01，與正常組比較；②P ＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組二甲雙胍組鳶尾黃素組N/只12 12 12 12 TC 4.35±0.85 10.21±1.14①4.81±0.45②4.34±0.51②TG 1.35±0.10 4.54±0.15①1.53±0.06②1.37±0.05②LDL-C 1.40±0.12 3.31±0.45①1.43±0.09②1.32±0.18②HDL-C 2.12±0.21 1.78±0.09①1.92±0.08②1.89±0.19②

2.4 各組大鼠SOD、CAT、GSH 活性及MDA 含量比較表3結果顯示:與正常組比較，模型組大鼠血清SOD、CAT、GSH 活性顯著降低，MDA 含量顯著升高（均P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組、鳶尾黃素組大鼠血清SOD、CAT、GSH 活性顯著升高，MDA 含量顯著降低（均P＜0.01），且2 個治療組SOD、CAT、GSH 活性及MDA 含量比較，差異均無統計學意義（P ＞0.05）。

表3 各組大鼠SOD、CAT、GSH活性及MDA含量比較Table 3 Comparison of the activity of SOD，CAT and GSH，and MDA content in various groups(±s)

表3 各組大鼠SOD、CAT、GSH活性及MDA含量比較Table 3 Comparison of the activity of SOD，CAT and GSH，and MDA content in various groups(±s)

①P ＜0.01，與正常組比較；②P ＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組二甲雙胍組鳶尾黃素組N/只12 12 12 12 SOD（U/mg prot）89.65±0.00 32.14±3.24①89.61±0.45②93.02±0.51②CAT（U/mg prot）10.35±1.34 3.37±0.05①8.65±0.82②11.04±0.31②GSH（U/mg prot）6.56±0.12 1.02±0.45①5.45±0.09②6.52±0.18②MDA（nmol/mg prot）4.54±0.20 11.78±0.23①7.54±0.18②4.12±0.25②

2.5 各組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較表4結果顯示:與正常組比較，模型組血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組、鳶尾黃素組血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平顯著降低（P＜0.01），且2 個治療組TNF-α、IL-6、IL-1β 水平比較，差異均無統計學意義（P ＞0.05）。

表4 各組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較Table 4 Comparison of the levels of serum inflammatory cytokines TNF-α，IL-6，IL-1β in various groups [±s，ρ/（ng·mL-1）]

表4 各組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較Table 4 Comparison of the levels of serum inflammatory cytokines TNF-α，IL-6，IL-1β in various groups [±s，ρ/（ng·mL-1）]

①P ＜0.01，與正常組比較；②P ＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組二甲雙胍組鳶尾黃素組N/只12 12 12 12 TNF-α 10.14±1.34 51.31±6.46①25.61±2.54②30.98±3.39②IL-6 12.10±2.51 54.05±5.35①26.32±3.86②35.76±5.06②IL-1β 0.08±0.01 0.64±0.08①0.34±0.03②0.44±0.05②

2.6 各組大鼠腎組織病理表現比較圖3 結果顯示:與正常組比較，模型組大鼠腎組織表現出明顯的病理損傷，可見腎小球數量減少，腎小管水腫、擴張，空泡化，炎性細胞浸潤，纖維化，細胞充血，部分區域可見蛋白管型。與模型組比較，二甲雙胍組、鳶尾黃素組大鼠腎組織病理損傷程度有所減輕。

2. 7 各組大鼠腎組織cleaved caspase-3 表達比較圖4 結果顯示:cleaved caspase-3 的免疫組織化學陽性染色主要位于細胞漿內，少數也見于胞核，呈棕褐色。模型組大鼠腎組織cleaved caspase-3 陽性表達率高于正常組（P＜0.01）；二甲雙胍組、鳶尾黃素組大鼠腎組織cleaved caspase-3 陽性表達率低于模型組（P＜0.01），且2 個治療組cleaved caspase-3 陽性表達率比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。

圖3 各組大鼠腎組織病理表現比較（HE染色，×400）Figure 3 Comparison of the pathological features of kidney tissue of various groups（by HE staining，×400）

圖4 各組大鼠腎組織cleaved caspase-3表達比較(±s)Figure 4 Comparison of the expression of cleaved caspase-3 in kidney tissue of various groups(±s)

2.8 各組大鼠腎組織P-NF-κB p65/NF-κB p65 表達水平比較圖5 結果顯示: 模型組大鼠腎組織P-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平高于正常組（P＜0.01）；二甲雙胍組、鳶尾黃素組腎組織P-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平低于模型組（P＜0.01），且2個治療組P-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。

3 討論

糖化血紅蛋白是紅細胞中血紅蛋白與葡萄糖持續且不可逆地進行非酶促蛋白糖基化反應的產物，其水平可反映檢測前120 d 內的平均血糖水平，是判斷糖尿病患者長期血糖控制情況的良好指標[13]。本研究結果顯示，鳶尾黃素可降低DN 大鼠血糖含量、糖化血紅蛋白水平，表明鳶尾黃素具有降低DN大鼠血糖的作用。

圖5 各組大鼠腎組織P-NF-κB p65/NF-κB p65表達水平比較(±s)Figure 5 Comparison of the expression levels of P-NFκB/NF-κB p65 in kidney tissue of various groups(±s)

DN 患者的腎功能損害主要以腎功能下降為主要表現，作為常見的反應腎臟功能狀態的指標，臨床上可通過檢測BUN、SCr、24hUP 水平，對患者的腎功能進行判斷，從而判定患者是否為DN[14]。DN 患者中，BUN、SCr、24hUP 均呈現明顯的升高趨勢[15]。本研究結果顯示，鳶尾黃素可降低DN 大鼠的BUN、SCr、24hUP 水平及腎質量/體質量指數，減輕腎組織病理損傷程度，表明鳶尾黃素有改善DN大鼠腎功能和結構的作用。

脂質代謝紊亂被普遍認為是糖尿病及其并發癥的原發病理生理改變，血脂異常在DN 的發病機理中起作用，較低的LDL-C 和TG 水平與從中度白蛋白尿進展為嚴重白蛋白尿或終末期腎病的風險降低相關[16]。TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平的高低是反映胰島素抵抗、氧化應激和動脈粥樣硬化的有力指標[17]。改善脂質代謝是治療DN 的有效方法。LDL-C 水平的持續升高和HDL-C 水平的降低會導致腎臟形態和功能的改變[18]。本研究結果顯示，鳶尾黃素可降低DN 大鼠TC、TG、LDL-C 水平和升高HDL-C 的水平，表明鳶尾黃素可通過改善脂質代謝紊亂對DN大鼠腎功能起到保護作用。

研究[19]證明，抑制炎癥細胞募集到腎臟中對實驗性DN 具有保護作用。IL-6是一種26 kDa的細胞因子，在急性期反應物和慢性炎癥的產生中具有調節作用，雖然不是典型的炎癥性疾病，但DN現在被認為涉及慢性低度炎癥[20]。隨著DN 的進展，機體尿液和血清IL-6增加[21]。IL-1β有助于炎性細胞募集，TNF-α 是DN 的介質，在其發病機制中起重要作用。本研究結果顯示，鳶尾黃素可降低DN 大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平，表明鳶尾黃素可通過降低炎癥因子對DN 大鼠起到保護腎功能的作用。

氧化應激已經成為DN 的重要新靶標。因過量產生活性氧（ROS）導致的不平衡氧化還原信號傳導加劇了腎損傷。SOD、CAT、GSH 是體內抗擊ROS的防線，是評價體內氧化應激的重要指標[22]。MDA 是前列腺素的代謝產物，高血糖和高血脂會導致脂質的過氧化及自由基的增加，促MDA 生成[23]。本研究結果顯示，鳶尾黃素可升高DN 大鼠SOD、CAT、GSH 活性，降低MDA 含量，表明鳶尾黃素可通過調節氧化應激指標對DN 大鼠起到保護腎功能的作用。

DN 的病因是多因素的，以高血糖、氧化應激、晚期糖基化終產物和血管緊張素Ⅱ為主導因子，每一種因素都能激活NF-κB，這是控制宿主表達的主要轉錄因子[24]。NF-κB 可調節DN 中的慢性炎癥、纖維化，組織重塑相關的粘附分子，并促炎癥細胞因子和趨化因子的表達[25]。抑制NFκB可能為DN提供有效的治療選擇[26]。本研究結果顯示，鳶尾黃素可降低DN 大鼠腎組織P-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達水平，表明鳶尾黃素可能通過抑制NF-κB通路改善大鼠DN。

Caspase-3 作為凋亡執行因子， 其活化后成為cleaved caspase-3 是細胞凋亡不可逆的標志[27]。本研究結果顯示，鳶尾黃素可降低DN 大鼠腎組織cleaved caspase-3 陽性表達率，表明鳶尾黃素可通過抑制DN 大鼠腎組織細胞凋亡起到保護腎功能的作用。

綜上所述，鳶尾黃素可有效改善DN 幼齡大鼠的高血糖、高血脂、腎組織病理損傷和腎功能異常，其機制可能與抑制體內氧化應激、炎癥因子的釋放和活化、細胞凋亡等有關。本研究探討了鳶尾黃素對DN大鼠的治療作用和鳶尾黃素治療DN的潛力，為臨床應用鳶尾黃素治療DN 提供了實驗依據。