通腑降濁方對便秘型腸易激綜合征大鼠糞便菌群結構的影響

劉永， 谷諾諾

（石家莊市中醫院東院區，河北石家莊 050051）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是結腸的一種功能性疾病，臨床多見，常因患者的結腸蠕動、環形肌收縮、黏液分泌等功能出現紊亂而導致各種癥狀，與精神因素關聯密切，以腹痛、腹脹等腹部不適及排便習慣、大便性狀異常為臨床表現，癥狀持續或間歇發作[1]。IBS 便秘型（IBS-C）是其亞型之一[2]。流行病學調查報告顯示:我國IBS-C 發病率約占26.70%[3]，逐年增高，且癥狀頑固，嚴重影響患者生活質量，但研究較少，發病機制不明確，西醫藥治療作用局限。導師楊倩教授基于文獻研究及臨床實踐，發現中醫辨治本病有標本兼治、減少復發等優勢，結合“濁毒理論”，自擬通腑降濁方治療本病，見效頗多，但機理未明，推廣受限。多項研究發現，IBS的發病與腸道微生物有密切關系，腸道菌群是一個復雜而龐大的微生態系統，往往通過“微生物—腦—腸軸”而影響本病[4]，因此，我們以大鼠糞便菌群的變化為切入點，以IBS-C模型大鼠為研究對象，探討腸道微生物的變化，進而明確通腑降濁方治療本病的作用機制，開拓中藥研究思路，并豐富臨床治療本病的理論和實驗依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物6 周齡清潔級雄性健康SD 大鼠49 只，體質量（100 ± 20）g，購自河北醫科大學動物實驗中心，實驗動物許可證號:SCXK（冀）2013-1-003，動物質量合格證號:1610300。

1.2 實驗藥物通腑降濁方免煎顆粒劑（柴胡9 g、枳實9 g、白芍12 g、檳榔6 g、黃連6 g、飛揚草10 g、八月札10 g、冬葵子6 g、茯苓12 g、火麻仁9 g、羅漢果10 g、干姜6 g、甘草6 g），由廣東一方制藥有限公司提供，按比例溶于蒸餾水配制成質量濃度為1.156、2.313、4.625 g/mL 的溶液。西沙必利片（規格:5 mg/片），西安楊森制藥有限公司生產，國藥準字H10960289，溶于蒸餾水配成0.9 g/L混懸液。乳果糖口服溶液（規格:667 g/L；批準文號:進口藥品注冊證號H20120387），由荷蘭Abbott Biologicals B.V.公司生產，溶于蒸餾水配成416.875 g/L溶液。

1. 3 實驗試劑與儀器蘇木素—伊紅染色液（天津市永大化學試劑開發中心）；VECTASTAIN ABC試劑（美國Vecteor 公司）； TruSeq PCR-Free DNA建庫試劑盒（美國Illumina 公司）；GeneJET 膠回收試劑盒（美國Thermo Scientific 公司）；DNA 提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）。Illumina HiSeq2500 測序平臺（美國Illumina 公司）；ABI Gene Amp9700 型PCR 儀（美 國Gene 公 司）；Sartorious 精密電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；灌胃針（北京廣源達科技發展有限公司）；HMIAS-2000 顯微圖像分析系統（武漢同濟醫科大學）；8-F兒童型帶氣囊導尿管（南通三利醫療器械有限公司）。

1.4 動物分組與處理將大鼠按照隨機數字表分為正常組，模型組，西沙必利組，益生元組，中藥高、中、低劑量組，每組各7只，并將除正常組外統稱為造模組。將造模組大鼠給予普通飼料喂養7 d 適應實驗室環境后，采用冰水灌胃法建立IBS-C大鼠模型[5]，即每日8∶30給予大鼠0 ～4 ℃冰水混合物灌胃，共14 d。每日于灌胃前稱取大鼠體質量，于灌胃后更換大鼠墊料，24 h后撿取大鼠糞便，稱取糞便質量，記錄糞便粒數，觀察糞便硬度及形態。若見大鼠糞便質硬、形狀變小、含水量減少，鼠性易激惹，可判斷造模成功[6]。

造模成功后，根據公式[大鼠每日用藥劑量=成人每日用藥總量/一般成人體質量（60 kg）× 10×大鼠體質量][7]（正常成人每日口服中藥顆粒劑量為111 g，每日口服西沙必利片15～30 mg，口服乳果糖口服溶液15 mL）換算各組灌胃給藥劑量。正常組與模型組:給予等體積生理鹽水灌胃，每日1 次；西沙必利組:給予西沙必利片0.9 g/L 混懸液，按劑量為3.6 mg·kg-1灌胃，每日1次；益生元組:予乳果糖口服藥417 g/L 溶液，按劑量為1 667.5 mg·kg-1灌胃，每日1 次；中藥高、中、低劑量組:將通腑降濁方顆粒劑溶于蒸餾水分別配成濃度為4.625、2.313、1.156 g/mL 的溶液，按劑量為18.500、9.250、4.625 g·kg-1灌胃，每日1次。

1. 5 觀察指標與方法（1）觀察大鼠精神、體質量、飲食、毛發、尿量、糞便含水量及粒數等一般狀況，判斷造模成功與否及治療后療效。糞便含水量=（濕糞質量- 干糞質量）/濕糞質量×100%。（2）末次灌胃禁食24 h 后，收集大鼠2 粒糞便（不低于0.5 g），置入液氮中保存，后移交于北京諾禾致源生物信息科技有限公司，應用16S rDNA 擴增子測序技術，采用高通量測序，通過提取糞便DNA、瓊脂糖凝膠電泳檢測、PCR、HiSeq上機測序、操作分類單元（OTUs）聚類和物種分類，再對OTUs 進行豐度、多樣性指數、聚類、統計等分析檢測大鼠糞便微生物群落結構。（3）采取斷頭法處死大鼠，快速剖取結腸，用生理鹽水沖洗，用體積分數10%中性甲醛溶液于瓶裝容器中固定，依此用60%乙醇（體積分數，下同）、75%乙醇各60 min、80%乙醇18 h、90%乙醇4 h、95%乙醇1.5 h、無水乙醇1 h 脫水；二甲苯透明后常規石蠟包埋切片，制作2 μm 厚石蠟切片，80 ℃烤片30 min，常溫保存備用。HE 染色觀察結腸組織病理變化。

1.6 統計方法采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計量資料正態分布且方差齊者以均數± 標準差(±s) 表示，偏態分布的資料常用中位數和四分位數間距表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用SNK 法，若不滿足正態分布，采用非參數檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 大鼠一般狀況正常組大鼠一般狀況良好，糞便質軟，色黃，如麥粒狀。造模組大鼠情緒易激惹，毛發亂，飲食減少，糞便質硬，色白，量少，多呈小黃豆狀，提示造模成功。給藥后，各治療組大鼠情緒較之前穩定，糞便質地變軟，數量增多，進食及毛發光澤好轉，提示各組藥物治療有效，且肉眼未見明顯差別，各階段均無大鼠死亡、腹瀉現象。每日于灌胃前記錄各組大鼠體質量，發現各組大鼠體質量于實驗期間均平穩增長，且增長趨勢基本一致，各組間無統計學差異（P ＞0.05）。

2.2 各組大鼠糞便含水量及糞便粒數比較造模結束后，各造模組大鼠糞便含水量及糞便粒數較正常組明顯減少（P ＜0.05），各造模組之間糞便含水量及糞便粒數無明顯差異（P ＞0.05），提示造模成功。各治療組分別給予對應治療后糞便含水量及糞便粒數較模型組均有所增加（P ＜0.05），但仍低于正常組（P ＜0.05）。各治療組間比較:中藥各劑量組間糞便含水量及糞便粒數無明顯差異（P ＞0.05）；中藥各組糞便含水量及糞便粒數與益生元組比較，差異亦無統計學意義（P ＞0.05），但與西沙必利組比較，糞便含水量及糞便粒數均明顯增多，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠糞便含水量及糞便粒數比較Table 1 Comparison of fecal moisture content and faeces number in rats of the various groups (±s)

表1 各組大鼠糞便含水量及糞便粒數比較Table 1 Comparison of fecal moisture content and faeces number in rats of the various groups (±s)

①P ＜0.05，與正常組比較；②P ＜0.05，與模型組比較；③P ＜0.05，與西沙必利組比較

組別正常組模型組西沙必利組益生元組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組N/只7777777糞便含水量（p/%）治療前44.77±1.21 30.50±0.85①30.63±1.62①30.43±1.23①30.70±1.00①30.77±1.19①30.40±1.62①治療后44.59±1.49 30.80±1.48①39.27±1.21②41.80±0.86②③41.29±1.75②③42.30±1.34②③42.59±1.12②③糞便粒數（n/粒）治療前53.57±5.56 37.40±5.09①37.14±4.38①36.63±5.11①37.29±3.35①37.06±5.58①36.37±5.15①治療后52.66±6.03 35.00±2.52①39.57±3.31②44.29±4.54②③45.71±3.50②③46.71±3.95②③47.29±4.11②③

2.3 各組大鼠結腸組織病理學形態比較剖取結腸，HE 染色后通過顯微鏡觀察結腸組織病理學變化，結果顯示:各組大鼠結腸黏膜層完整，無充血、水腫、炎細胞浸潤、糜爛、潰瘍等異常改變，符合IBS-C之功能性胃腸病表現。見圖1。

圖1 各組大鼠結腸組織病理學形態比較（HE染色）Figure 1 Comparison of the pathological features of colon tissues in various groups（by HE staining）

2.4 各組大鼠糞便微生物群落結構比較

2. 4. 1 物種相對豐度展示 根據物種注釋結果，選取每個分組在門（Phylum）、屬（Genus）水平上最大豐度排名前10 位的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖，以便直觀查看各樣品在該水平上相對豐度較高的物種及其比例。如圖2 所示，橫坐標（sample name）是樣品名，縱坐標（relative abundance）表示相對豐度，Others 表示圖中這10 個門/屬之外的其他所有門/屬的相對豐度之和。在門水平，各組均有5 個相同的優勢物種，即厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、柔膜菌門（Tenericutes），相對豐度之和所占比例均超過95%，而各個物種在各組的相對豐度卻不盡相同。可見，在門水平，各組大鼠糞便菌群優勢物種未變，但豐度發生了明顯變化，其中厚壁菌門和擬桿菌門數量最多，變化較大；治療后異常的菌群結構趨近于正常組，各治療組間不盡相同，中藥3 個劑量組間菌群結構更相近。

在屬水平，各組均有10 個相同的優勢物種:乳酸菌（Lactobacillus）、異花菌（Allobaculum）、普雷沃 氏 菌NK3B31（Prevotellaceae_NK3B31_group）、普氏菌（Prevotella_9）、Romboutsia、Alloprevotella、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、普雷沃氏菌UCG-003（Prevotellaceae_UCG - 003）、 產 氣 柯 林 斯 菌（Collinsella）、Blautia；而各個菌及其總和在各組的相對豐度卻不盡相同。見圖3。可見，在屬水平，與門水平相似，各組優勢菌種未變，但菌群結構明顯改變；治療后異常的菌群結構趨近于正常組。

圖2 各分組門水平上的物種相對豐度柱形圖Figure 2 Comparison of the relative richness of species at phylum in various groups

圖3 各分組屬水平上的物種相對豐度柱形圖Figure 3 Comparison of the relative abundance of species at genus in various groups

2. 4. 2 稀釋曲線（rarefaction curve） 稀釋曲線，是從樣品中隨機抽取一定測序量的數據，統計它們所代表物種OTUs 的數目，以抽取的測序數據量與對應的物種數來構建曲線。稀釋曲線可直接反映測序數據量的合理性，并間接反映樣品中物種的豐富程度，當曲線趨向平坦時，說明測序數據量漸進合理，更多的數據量只會產生少量新的物種。如圖4所示，曲線趨于平穩，提示本實驗所采取測序數據量能夠覆蓋絕大多數細菌物種，滿足后續分析，且模型組物種豐富度明顯降低，治療后物種豐富度趨近于正常組，其中中藥高劑量組、益生元組較之更近。

圖4 各組稀釋曲線Figure 4 Rarefaction Curves

2. 4. 3 Alpha 多樣性指數組間差異分析 本實驗選用ACE 指數計算菌群豐度，其值越大，物種越豐富；Shannon 指數計算菌群多樣性，其值越大，說明群落多樣性越高。對不同樣品的2個指數進行Wilcox 秩和檢驗，并通過箱形圖（見圖5、6）展示，可見除正常組與益生元組、中藥高劑量組，西沙必利組與益生元組、中藥低劑量組、中藥中劑量組，益生元組、中藥低劑量組與中藥中劑量組之間，其余各組間均有統計學差異（P ＜0.05），其中:模型組ACE 指數值（即菌種豐度）較正常組顯著降低，各治療組ACE 指數值均較模型組升高，尤以中藥高劑量組及益生元組接近正常組；各組之間Shannon 指數均無統計學差異（P ＞0.05），說明各組間菌群多樣性無顯著差異。

圖5 各組ACE指數組間差異箱形圖Figure 5 The inter-group difference box diagram of ACE

圖6 Shannon指數組間差異箱形圖Figure 6 The inter-group difference box diagram of Shannon

2. 4. 4 Beta Diversity 指數—距離矩陣熱圖 Beta多樣性研究中，選用Weighted Unifrac 距離和Unweighted Unifrac 距離2 個指標來衡量2 個樣品間的相異系數，其值越小，表示這2個樣品在物種多樣性方面存在的差異越小。以Weighted Unifrac 和Unweighted Unifrac 距離繪制的Heatmap 展示結果見圖7所示:各組之間均有差異。模型組與正常組的差異最大，提示IBS-C 大鼠菌群結構明顯紊亂；各治療組與正常組的差異較模型組與正常組的差異減小，提示治療均有效，能調節紊亂的腸道菌群，且中藥高劑量組調節菌群失調作用最好。

圖7 各組Beta多樣性指數距離矩陣熱圖Figure 7 The beta diversity index chart

2. 4. 5 不加權算術平均聚類方法（UPGMA）聚類樹 為了研究不同樣品間的相似性，本實驗通過以Weighted Unifrac 距離矩陣對樣品進行UPGMA 聚類分析，構建樣品的聚類樹，并將聚類結果與各樣品在門水平上的物種相對豐度整合展示，見圖8。圖8示左側是UPGMA聚類樹結構，右側為各樣品在門水平上的物種相對豐度分布圖，分析表明在門水平上，微生物群根據進化關系聚類為兩大分支，模型組、西沙必利組、益生元組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組聚為一支，正常組單獨為一支，說明正常組的細菌群落與其他各組有明顯的不同。此外，中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、益生元組距離較近，表示菌群結構相似，且中藥低劑量組、中藥中劑量組最為相似，提示對腸道菌群改善作用接近；西沙必利組與模型組距離較近，表示菌群結構相似度高，提示西沙必利組對IBS-C模型大鼠腸道菌群紊亂改善作用相對不明顯。

圖8 各組不加權算術平均聚類方法（UPGMA）聚類樹Figure 8 UPGMA clustering tree

3 討論

中醫古籍中并無腸易激綜合征（IBS-C）病名的記載，根據其臨床癥狀，多將其歸屬于“便秘”“脾約”“腹痛”“郁證”“不更衣”“陰結”“陽結”等范疇，歸結其病因為飲食不節、起居失調、外邪侵襲、情志不暢、稟賦不足等，主病之臟屬脾胃，與肝相關，甚則累及心、腎，病機不外乎熱結、氣滯、寒凝、氣血陰陽虧虛引起的腸道傳導失司[9]，正合《蘭室秘藏·結燥論》曰:“若饑飽失節，勞逸過度，損傷胃氣，及含辛熱厚味之物，伏于血中，耗散真陰，津液虧少，故大便燥結。”治療多以順氣導滯、通腑泄熱、溫通寒積、補益虛損、潤腸通便，臨床癥狀可緩，但難以根治，間斷復發。對此，導師楊倩教授結合“濁毒理論”，著眼于當今人們生活節奏加快，社會壓力增大，多食肥膩、辛辣、煎炸，食品不安全等現狀，認為其病損傷脾胃，且使身心俱疲，情志不舒，木郁克土，致脾胃失健，氣機失宣，水濕不運，若內停中焦，蘊久成濁，濁邪凝滯氣機，致腸腑不通，郁而化熱，熱甚釀毒，壅滯腸腑，灼傷津液，致大腸傳導失司，糟粕內停，濁毒滯留不去，使病程纏綿反復，日久變生他證。因此，提出“濁毒內蘊，腑氣不通”是本病反復發作、難以治愈的關鍵[10]，自擬通腑降濁方，創立通腑降濁法治療本病，見效靈驗。但由于機理不明，使其應用受限，因此，我們開展此次實驗研究，以求探索。

肝郁、氣滯貫穿本病，往往招致郁怒，脅、腹痛、脹，本研究以柴胡、八月札、白芍疏肝理氣、柔肝止痛。柴胡疏肝理氣，解郁化濁，性善調達肝氣，為治療肝氣郁結之要藥；如《神農本草經》曰:“主心腹腸胃中結氣，……推陳致新；”現代藥理研究表明，其可抗炎、鎮痛、提高免疫力[11]。八月札疏肝理氣，健脾利胃止痛，《本草拾遺》曰:“利大小便，宣通……食之令人心寬……下氣；”現代藥理研究表明，其可抗炎、抗腫瘤、抗血栓[11]。白芍柔肝止痛，養血斂陰，肝體陰而用陽，本品酸斂肝陰，常配伍柴胡，養肝體，疏肝用，《滇南本草》言:“收肝氣逆疼，調養心肝脾經血，舒經降氣，止肝氣疼痛”；現代藥理研究表明，其可鎮痛、解痙、抗炎[11]。方選枳實、檳榔消積導滯，通腑降濁止痛。枳實可破氣除痞，行滯止痛，《藥品化義》曰:“主中脘以治血分，療臍腹間實滿，消痰癖，祛停水，逐宿食，破結胸，通便閉”；現代藥理研究表明，其可緩解小腸痙攣、增加胃腸收縮節律[11]。檳榔善行胃腸之氣，治療食積氣滯，腹脹便秘等證，現代藥理研究表明，其確可增加腸蠕動[11]。方選火麻仁、羅漢果通腑降濁，潤腸通便。《藥品化義》言:“麻仁，能潤腸，體潤能去燥，專利大腸氣結便秘；”現代藥理研究表明，其可刺激腸壁，促進腸道蠕動[11]。二者配伍枳實、檳榔行氣導滯增通便之功。此外，方用黃連、飛揚草、冬葵子清熱燥濕，化濁解毒，抗菌消炎，改善腸道菌群[11-12]；茯苓、甘草健脾益氣和中，加干姜溫中散寒，使濁去熱清，但無礙脾胃，無過寒涼。

腸道菌群是一個復雜而龐大的微生態系統，可參與宿主的生理、生化、病理、藥理及其他各方面的生理及結構的發生、發育和衰退的全過程。數量龐大的腸道菌與宿主間相互依存、相互作用，構成微生態平衡，維持機體健康。當外界環境改變，微生態平衡被破壞，從而引發各種疾病[13]，IBS 即為其中之一。本實驗結果表明，通腑降濁方、西沙比利、益生元均能緩解大鼠便秘，但通腑降濁方及益生元效果更好。IBS-C 大鼠腸道確無器質性病變，但菌群紊亂，菌種豐富度下降，且多樣性未變，無明顯致病菌滋生，口服通腑降濁方及西沙比利、益生元均能調整紊亂的腸道菌群，但調控效果不盡相同，且不同劑量通腑降濁方作用不同。通腑降濁方高劑量組與益生元組調控作用最接近，其結果也更接近于正常組。提示上述3種藥物均可通過調整患者紊亂的腸道菌群發揮對IBS-C 的治療作用，通腑降濁方效果最好。而通腑降濁方劑量的選擇對通腑降濁方的治療效果有重要的影響。通腑降濁方療效仍與正常大鼠保留顯著差異，尚需開展更標準用藥劑量、更大樣本、長療程的臨床和實驗研究探討更精準的治療方案。