大米蛋白水解條件的響應面法優(yōu)化*

黃艷燕，王 升，馮 濤，唐智慧，莫君明,4**

(1.廣西科學院，非糧生物質酶解國家重點實驗室，國家非糧生物質能源工程技術研究中心，廣西南寧 530007；2.南寧龐博生物工程有限公司，廣西南寧 530004；3.廣西民族大學化學化工學院，廣西林產化學與工程重點實驗室，廣西南寧 530006； 4.南寧穗肽生物技術有限公司，廣西南寧 530006)

0 引言

大米是全球范圍內種植的主要糧食之一，大米中所含的蛋白質是公認的優(yōu)質谷類蛋白，大米蛋白氨基酸組成合理，含有人體所需多種氨基酸，具有極高的營養(yǎng)價值[1]。目前大米蛋白主要被加工成高蛋白粉、蛋白胨和大米蛋白發(fā)泡粉等產品[2]。另外，大米蛋白是低抗原性蛋白質，過敏性低，適用作易過敏人群和嬰幼兒的蛋白質補充劑[3]。同時，大米蛋白的保健功能也受到很多研究者的關注，比如大米蛋白能預防糖尿病、高血壓等慢性疾病[4]。但是由于大米蛋白溶解性較差，導致其乳化性、膠凝性等性質不佳，進而影響大米蛋白在食品領域的進一步開發(fā)利用[5]。

為改善大米蛋白的功能性質，目前常用物理法、化學法或酶法對大米蛋白進行改性，主要以溶解度、乳化性和起泡性等性質的提升為目標[6]。物理法改性成本低、毒副作用小，但是改性效果不明顯，提取率低[7]。化學法改性應用最為廣泛，對大米蛋白的功能性質有較大改善，但缺點是有時會破壞蛋白質的原有營養(yǎng)特性，且存在化學試劑殘留的隱患[8]。酶法改性專一性高、反應條件溫和，對環(huán)境的污染小、適合工業(yè)化生產、水解產物營養(yǎng)價值高，是目前研究的熱點[9]，如汪洋等[10]研究中性蛋白酶制備大米蛋白抗氧化肽的酶解工藝。但是目前酶法水解大米蛋白的研究主要集中在考察蛋白質的水解度和蛋白肽的抗氧化活性，其中大多數研究的蛋白水解度不高(<30%)[5，11-12]，且不涉及蛋白質提取率。對工業(yè)生產而言，水解度和蛋白質提取率都是生產中決定產品質量和生產成本的重要指標。本實驗以大米蛋白粉為原料，采用大米蛋白水解酶對大米蛋白進行酶解，以水解度和蛋白質提取率為指標，通過單因素實驗和響應面分析實驗確定最優(yōu)條件，為酶解制備可溶性大米蛋白肽的工業(yè)化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

大米蛋白粉(粗蛋白質70%)，大海糧油工業(yè)(防城港)有限公司生產；大米蛋白水解酶(為木瓜酶、風味酶和堿性酶的復合物，8 000 U/g——在一定的條件下，每分鐘水解酪蛋白生成1 μg 酪氨酸所需的酶量，為 1 個酶活力單位U)，南寧穗肽生物技術有限公司生產；其他試劑，國產分析純。

1.2 儀器

DK-8D型電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司生產；DELTA320型pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產；RD-50GAT型臺式離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司生產；KDN-1型凱氏定氮儀，上海儀電科學儀器股份有限公司生產。

1.3 方法

1.3.1 大米蛋白粉的酶法水解

稱取大米蛋白粉10 g，加入100 mL蒸餾水，用0.1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸溶液調至酶的最適pH值，加入一定量的水解酶，在預定溫度的水浴鍋中恒溫酶解，達到酶解時間后，于沸水中水浴15 min使酶失活，自然冷卻，4 000 r/min離心20 min，取上清液測定游離氨基氮的含量和總氮含量，并計算大米蛋白的水解度和蛋白質提取率。

1.3.2 大米蛋白水解度和蛋白質提取率的計算

游離氨基氮的測定采用甲醛電位滴定法，總氮含量測定采用凱氏定氮法。

大米蛋白水解度=氨氮/總氮×100%，蛋白質提取率=酶解液的粗蛋白質/原料的粗蛋白質×100%。

1.3.3 單因素實驗

設定初始水解條件：酶添加量2.0%(W∶W)，pH值為8，溫度60℃，酶解時間9 h。在此基礎上分別改變酶添加量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)，pH值(6，7，8，9，10)，溫度(40，50，60，70，80℃)，酶解時間(3，6，9，12，15 h)，測定大米蛋白的水解度和蛋白質提取率。

1.3.4 響應面法分析實驗

根據單因素實驗的結果，以大米蛋白水解度和蛋白質提取率為響應值，選取酶添加量、溫度、pH值、酶解時間4個因素進行Box-Behnken實驗設計，確定大米蛋白水解的最優(yōu)條件。實驗因素水平如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗設計因素水平編碼表

Table 1 Coding table of factors and levels used in Box-Behnken test design

水平Level因素Factors溫度Temperature(℃)酶添加量Enzyme addition (%)pH值pH value時間Time (h)-1501.5760602.0891702.5912

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 酶添加量對大米蛋白水解度和提取率的影響

由圖1可知，隨著酶添加量的增加，大米蛋白的水解度和蛋白質提取率均有提高，當酶添加量達到2.0%之后，水解度和提取率增幅較小。這是由于酶作為一種催化劑，濃度的提高可以加快反應速度，但是在酶添加量達到一定限度時，酶在底物表面的作用已達到飽和，而底物上可供酶切割的位點有限，多出的酶不能在底物上起作用[13]，因此水解度趨于平衡。從成本的角度考慮，初步確定酶添加量為2.0%較為合適。

圖1 酶添加量對水解度和提取率的影響

Fig.1 Effect of enzyme addition on the degree of hydrolysis and protein extraction rate

2.1.2 溫度對大米蛋白水解度和提取率的影響

從圖2可知，大米蛋白水解度和蛋白質提取率在60℃時最高，溫度太低或太高時水解度和蛋白質提取率均會下降。這是由于酶對溫度較為敏感，在其最適溫度范圍內活性最高。溫度較低時，酶活力也較低，水解速度慢，而當溫度過高時酶蛋白質會因變性而失活，造成水解度和提取率的下降[14]。因此初步選擇反應溫度為60℃。

圖2 溫度對水解度和提取率的影響

Fig.2 Effect of temperature on the degree of hydrolysis and protein extraction rate

2.1.3 pH值對大米蛋白水解度和提取率的影響

由圖3可見，在pH值為8時水解度和蛋白質提取率達到最大，pH值低于或高于8時，水解度和蛋白質提取率均有所降低。這是由于pH值會影響酶分子和底物分子上羧基、氨基等基團的解離狀態(tài)，這些基團的解離狀態(tài)會影響酶與底物的結合催化[15]。因此初步確定pH值為8。

2.1.4 酶解時間對大米蛋白水解度和提取率的影響

從圖4可以看出，隨著酶解時間的延長，水解度和提取率都會逐漸提高。但由于底物濃度不斷降低，酶解9 h之后水解度和提取率的增長趨于平緩。因此，從節(jié)約成本角度考慮，初步將酶解時間定為9 h。

圖3 pH值對水解度和提取率的影響

Fig.3 Effect of pH value on the degree of hydrolysis and protein extraction rate

圖4 酶解時間對水解度和提取率的影響

Fig.4 Effect of time on the degree of hydrolysis and protein extraction rate

2.2 響應面實驗數據分析

2.2.1 實驗模型的建立

根據單因素實驗結果，以溫度(A)、酶添加量(B)、pH值(C)、酶解時間為自變量(D)，水解度(DH)和蛋白質提取率(E)為響應值，進行響應面實驗，實驗方案和結果見表2。

表2 實驗方案和結果

Table 2 Experiment design and result

實驗號No.溫度Temperature酶添加量Enzyme additionpH值pH value酶解時間Time水解度Hydrolysis degree (%)提取率Protein extraction rate (%)1-1-10029.178.821-10033.184.73-110034.184.94110037.788.5500-1-125.174.16001-128.677.8700-1128.279.98001136.883.99-100-128.979.4

續(xù)表2

Continued table 2

實驗號No.溫度Temperature酶添加量Enzyme additionpH值pH value酶解時間Time水解度Hydrolysis degree (%)提取率Protein extraction rate (%)10100-131.680.611-100133.983.212100136.989.0130-1-1024.975.51401-1031.980.2150-11032.280.116011036.385.217-10-1023.471.91810-1025.775.919-101028.676.320101032.480.2210-10-130.482.222010-136.689.6230-10137.590.324010140.893.225000040.590.326000040.091.527000039.191.928000039.490.729000039.691.1

用Design Expert 8.06軟件對表2的結果進行多元回歸分析，得到水解度(DH)與溫度(A)、酶添加量(B)、pH值(C)、酶解時間(D)的二次多項式回歸方程：

DH=39.72+1.62A+2.52B+2.98C+

2.74D-0.10AB+0.37AC+0.075AD-0.73BC-

0.73BD+1.27CD-4.80A2-1.15B2-7.46C2-

2.31D2。

由表3可知，模型P值<0.000 1，失擬項為0.704 2>0.05，表明該模型擬合程度較好；決定系數

R2=0.995 7，說明水解度實測值與預測值之間有較好擬合度。由表3中的F值大小順序可知，各因素對水解度的影響順序為C>D>B>A，即pH值>酶解時間>酶添加量>溫度。溫度(A)、酶添加量(B)、pH值(C)、酶解時間(D)的一次項及二次項均達到極顯著水平；交互項BC、BD、CD對水解度的影響也達到極顯著水平，交互項AB、AC和AD對水解度的影響不顯著。綜上分析可知該模型與實際情況擬合較好，可用于大米蛋白水解度的優(yōu)化。

表3 方差分析(水解度)

Table 3 Analysis of variance for the quadratic model (degree of hydrolysis)

來源Source平方和Sum of squares自由度Freedom均方Mean squaresF值F valueP值P value模型Model759.231454.23231.79<0.000 1A31.36131.36134.05<0.000 1B76.00176.00324.85<0.000 1C106.211106.21453.95<0.000 1D90.20190.20385.53<0.000 1AB0.04010.0400.170.685 5AC0.5610.562.400.143 3AD0.02310.0230.0960.761 0BC2.1012.108.990.009 6BD2.1012.108.990.009 6

續(xù)表3

Continued table 3

來源Source平方和Sum of squares自由度Freedom均方Mean squaresF值F valueP值P valueCD6.5016.5027.790.000 1A2149.291149.29638.10<0.000 1B28.5418.5436.51<0.000 1C2360.981360.981 542.90<0.000 1D234.61134.61147.94<0.000 1失擬項Lack of fit2.09100.210.700.704 2純誤差Pure error1.1940.30總和 Sum762.5028

同樣可得到提取率(E)與溫度(A)、酶添加量(B)、pH值(C)、酶解時間(D)的二次多項式回歸方程：

E=91.10+2.03A+2.50B+2.17C+2.98D-0.58AB-0.025AC+1.15AD+0.10BC-1.12BD+0.075CD-5.77A2-0.79B2-9.82C2-2.04D2。

由表4可知，模型P值<0.000 1，失擬項為0.440 7>0.05，表明該模型擬合程度較好；決定系數R2=0.993 7，說明提取率實測值與預測值之間有較好擬合度。由表4中的F值大小順序可知，各因素對提取率的影響順序為D>B>C>A，即酶解時間>酶添加量>pH值>溫度。一次項A、B、C、D對蛋白質提取率的影響達到極其顯著水平；交互項AD、BD對提取率的影響極顯著，其余交互項均不顯著。綜上分析可知該模型與實際情況擬合較好，可用于優(yōu)化蛋白質的提取率。

表4 方差分析(蛋白質提取率)

Table 4 Analysis of variance for the quadratic model (protein extraction rate)

來源Source平方和Sum of squares自由度Freedom均方Mean squaresF值F valueP值P value模型Model1 047.341474.81156.71<0.000 1A49.61149.61103.93<0.000 1B75.00175.00157.11<0.000 1C56.33156.33118.00<0.000 1D106.801106.80223.73<0.000 1AB1.3211.322.770.118 2AC0.002 510.002 50.005 20.943 3AD5.2915.2911.080.005 0BC0.04010.0400.0840.776 5BD5.0615.0610.600.005 7CD0.02210.0220.0470.831 3A2215.701215.70451.85<0.000 1B24.0714.078.520.011 2C2625.081625.081 309.40<0.000 1D227.04127.0456.64<0.000 1失擬項Lack of fit5.08100.511.270.440 7純誤差Pure errol1.6040.40總和 Sum1 054.0328

2.2.2 水解度的因素交互效應分析

響應面圖的等高線形狀反映交互作用的強弱程度，圓形表示兩個因素的交互作用不明顯，而橢圓形則表示交互作用明顯[16]。從圖5可以看出，水解度隨著酶解時間和酶添加量的增加而升高；水解度隨著pH值和溫度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。橢圓形的等高線說明交互作用對水解度影響顯著；pH值與溫度、酶添加量、酶解時間的交互作用顯著，表明pH值對水解度的影響比其他因素要大，與方差分析結果一致。

圖5 各因素交互效應的響應面曲線(水解度)

2.2.3 蛋白質提取率的因素交互效應分析

從圖6a可以看出，溫度一定時，隨著酶解時間的增加提取率緩慢升高；酶解時間固定時，隨著溫度升高，提取率是先增加再降低。從圖6b可知，酶添加量固定時，隨著酶解時間的增加提取率緩慢升高；當酶解時間一定時，隨著酶添加量的增加，提取率逐漸上升。圖6a等高線為橢圓形，說明時間-溫度交互作用顯著；而時間-酶添加量之間的交互作用亦較明顯(圖6b)，與方差分析結果一致。

2.2.4 酶解實驗的優(yōu)化與驗證

軟件優(yōu)化后的最佳水解條件：溫度61.72℃，酶添加量2.5%，pH值8.16，時間10.48 h，此時預測水解度為41.93%，預測提取率為93.52%。考慮到實際生產的方便，水解條件調整為溫度62℃，酶添加量2.5%，pH值8.2，時間10.5 h，預測水解度為41.93%，提取率為93.47%。按照優(yōu)化條件驗證實驗得到實際水解度為41.5%，提取率93.1%，兩者誤差小于1%，說明方程擬合較好，響應面優(yōu)化得到的酶解工藝參數準確。實驗結果表明響應面優(yōu)化得到的酶解條件相比現(xiàn)有的水解工藝在水解度(<30%)方面有較大提高，具有實用價值。

圖6 各因素交互效應的響應面曲線(蛋白質提取率)

Fig.6 Response surface map of cross effect of each factors (protein extraction rate)

3 結論

本實驗通過響應面實驗設計優(yōu)化了大米蛋白的酶解工藝。通過響應面法分析發(fā)現(xiàn)，酶解的溫度、酶添加量、酶解時間、pH值均對水解度和提取率有顯著影響。最后通過軟件得到優(yōu)化的酶解工藝條件：溫度62℃，酶添加量2.5%，pH值8.2，時間10.5 h，此時大米蛋白的水解度可達到41.5%，蛋白質提取率可達93.1%。本研究成果可為水解大米蛋白的實際生產提供參考。