益生菌與抗帕顆粒對(duì)帕金森病模型小鼠行為學(xué)影響的對(duì)比研究

王永兵，奚峰，蔣曉真，張麗婭，劉慧琴，楊娟，李剛，趙曉暉

近年隨著帕金森病（Parkinson's disease，PD）的深入研究，腸道菌群在該疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用不容忽視［1］，而通過改善腸道菌群失調(diào)有可能改善PD癥狀，延緩病情進(jìn)展。益生菌可通過調(diào)節(jié)腸道微生物成分而影響胃腸道上皮細(xì)胞、免疫系統(tǒng)及腸道神經(jīng)系統(tǒng)（包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞）。抗帕顆粒的有效成分可通過減輕腸道炎性反應(yīng)、抑制致病腸道細(xì)菌蛋白通過分子模擬機(jī)制而導(dǎo)致體內(nèi)α-syn異常折疊與沉積及沿腦腸軸神經(jīng)傳遞與沉積，從而改善便秘等PD癥狀，延緩病情進(jìn)展。本研究通過建立1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）致C57BL/6小鼠PD模型，比較益生菌、抗帕顆粒（具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)）對(duì)PD模型小鼠行為學(xué)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2018年9月—2019年10月完成實(shí)驗(yàn)。選取雄性SPF級(jí)健康C57BL/6小鼠111只，均由上海靈暢生物科技有限公司提供〔許可證編號(hào)：SCXK（滬）2018-0003〕，鼠齡8～12周，體質(zhì)量20～22 g，在復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)〔許可證編號(hào)：SYXK（滬）2015-0023〕，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，工作照度 150～300 Ix，動(dòng)物照度 15～20 Ix，12 h光照 /黑暗交替。

1.2 主要試劑 益生菌購(gòu)自上海信誼藥廠有限公司，抗帕顆粒由江蘇省南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院提供〔批準(zhǔn)文號(hào)：通制劑（2001）02-050〕，MPTP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 分組及干預(yù)方法 將111只健康C57BL/6小鼠隨機(jī)分為A組（正常對(duì)照，n=20）、B1組（PD模型對(duì)照，n=20）、B2組（PD模型并益生菌干預(yù)，n=20）、B3組（PD模型并抗帕顆粒干預(yù)，n=20），B4組（PD模型并益生菌聯(lián)合抗帕顆粒干預(yù)，n=20）。A組、B1組小鼠均給予0.9%氯化鈉溶液1 ml/d進(jìn)行灌胃，持續(xù)7 d，并正常喂養(yǎng)4個(gè)月。B2組小鼠給予益生菌溶液109個(gè)/d進(jìn)行灌胃；B3組小鼠給予抗帕顆粒（濃度800 mg/ml）40 mg·kg-1·d-1進(jìn)行灌胃；B4組小鼠給予益生菌聯(lián)合抗帕顆粒進(jìn)行灌胃（濃度同前），用法用量分別與B2組、B3組相同。B2組、B3組、B4組小鼠均每日上午9：00～10：00給藥，稱體質(zhì)量1次/周，并按照體質(zhì)量調(diào)整給藥量，連續(xù)喂養(yǎng)4個(gè)月。

1.4 PD小鼠模型制備 小鼠均腹腔注射MPTP 40 mg·kg-1·d-1制造 PD 模型，持續(xù) 7 d［2］。在第 1 批制模過程中發(fā)現(xiàn)，50只小鼠制模后次日即死亡11只，尸體解剖顯示均為腸壞死，究其原因?yàn)楦骨蛔⑸溥^深，穿刺入腸腔而導(dǎo)致腸壞死致死亡；經(jīng)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、規(guī)范穿刺方法使兩批小鼠共制模成功達(dá)到80只。

1.5 行為學(xué)觀察方法 分別于喂養(yǎng)后15 d及1、2、3、4個(gè)月每組每時(shí)間段選取8～10只小鼠在預(yù)定時(shí)點(diǎn)進(jìn)行行為學(xué)觀察，具體方法如下。

1.5.1 爬桿實(shí)驗(yàn) 將一直徑為25 cm的軟木球固定于一根長(zhǎng)50 cm、粗1 cm的木桿頂端，木桿上纏上紗布以防打滑，而后將受試小鼠放于軟木球上，記錄其從軟木球上下來所用時(shí)間、爬完木桿上半部及下半部所用時(shí)間，再按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)分：3 s內(nèi)完成上述某一動(dòng)作計(jì)3分；6 s內(nèi)完成上述某一動(dòng)作計(jì)2分；超過6 s完成上述某一動(dòng)作計(jì)1分［3］。分值越高表明小鼠肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)越佳。

1.5.2 懸掛實(shí)驗(yàn) 將受試小鼠懸掛于一水平電線上，將小鼠用兩后爪抓住電線計(jì)3分，用一后爪抓住電線記2分，兩后爪均抓不住電線計(jì)1分［4］。分值越高表明小鼠肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)越佳，反之則提示小鼠震顫、肌強(qiáng)直等情況嚴(yán)重。

1.5.3 游泳實(shí)驗(yàn) 將受試小鼠放入一個(gè)20 cm×30 cm×20 cm規(guī)格的水箱中10 min，水溫為22～25 ℃，受試時(shí)間為10 min。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：若小鼠在受試時(shí)間內(nèi)能持續(xù)不斷游泳計(jì)30分；大部分時(shí)間游泳僅偶爾漂浮計(jì)25分；漂浮時(shí)間占整個(gè)受試時(shí)間50%以上計(jì)20分；偶爾游泳計(jì)15分；偶爾用后肢游動(dòng)并漂浮在一邊計(jì)10分［5］。分值越高表明小鼠肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)越佳，反之則提示小鼠震顫、肌強(qiáng)直等情況嚴(yán)重。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生存情況 A組、B3組、B4組小鼠均存活；B1組小鼠喂養(yǎng)4個(gè)月時(shí)存活19只，1只進(jìn)食逐漸減少并于喂養(yǎng)第82天衰竭死亡；B2組小鼠喂養(yǎng)4個(gè)月時(shí)存活18只，2只均為進(jìn)食逐漸減少并分別于第68、91天衰竭死亡。

表1 五組小鼠各時(shí)間點(diǎn)爬桿實(shí)驗(yàn)分值比較（ ±s，分）Table 1 Comparison of pole test scores in the five groups at different time points

表1 五組小鼠各時(shí)間點(diǎn)爬桿實(shí)驗(yàn)分值比較（ ±s，分）Table 1 Comparison of pole test scores in the five groups at different time points

注：A組小鼠為正常，B1組小鼠為PD模型，B2組小鼠為PD模型并益生菌干預(yù)，B3組小鼠為PD模型并抗帕顆粒干預(yù)，B4組小鼠為PD模型并益生菌聯(lián)合抗帕顆粒干預(yù)；與A組比較，aP＜0.05；與B1組比較，bP＜0.05；與B2組比較，cP＜0.05

組別 只數(shù) 喂養(yǎng)15 d后 喂養(yǎng)1個(gè)月后 喂養(yǎng)2個(gè)月后 喂養(yǎng)3個(gè)月后 喂養(yǎng)4個(gè)月后A 組 20 7.4±1.5 8.1±1.3 6.9±1.5 8.1±1.3 9.3±1.8 B1 組 19 4.0±1.2a 5.4±1.2a 4.6±1.3a 5.2±1.8a 4.1±1.2a B2 組 18 4.2±1.4a 5.7±1.2a 4.7±1.1a 6.7±1.3ab 5.9±1.3ab B3 組 20 4.0±1.3a 4.9±1.2a 6.4±1.2bc 7.4±1.4b 7.9±1.4abc B4 組 20 4.6±1.4a 5.1±1.3a 6.6±1.2bc 6.9±1.6ab 7.4±1.5abc F值 F時(shí)間=1.965，F(xiàn)組間=2.272，F(xiàn)交互=3.408 P值 P時(shí)間=0.051，P組間=0.025，P交互=0.003

2.2 爬桿實(shí)驗(yàn)分值 時(shí)間與方法在爬桿實(shí)驗(yàn)分值上存在交互作用（P＜0.05）；方法在爬桿實(shí)驗(yàn)分值上主效應(yīng)顯著（P＜0.05）；時(shí)間在爬桿實(shí)驗(yàn)分值上主效應(yīng)不顯著（P＞0.05）。B1組、B2組各時(shí)間點(diǎn)，B3組喂養(yǎng)15 d及1、4個(gè)月后，B4組喂養(yǎng)15 d及1、3、4個(gè)月后爬桿實(shí)驗(yàn)分值低于A組；B2組喂養(yǎng)3、4個(gè)月后，B3組、B4組喂養(yǎng)2、3、4個(gè)月后爬桿實(shí)驗(yàn)分值高于B1組；B3、B4組喂養(yǎng)2、4個(gè)月后爬桿實(shí)驗(yàn)分值高于B2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.3 懸掛實(shí)驗(yàn)分值 時(shí)間與方法在懸掛實(shí)驗(yàn)分值上存在交互作用（P＜0.05）；時(shí)間、方法在懸掛實(shí)驗(yàn)分值上主效應(yīng)顯著（P＜0.05）。B1組各時(shí)間點(diǎn)，B2組喂養(yǎng)15 d及1、2、3個(gè)月后，B3組喂養(yǎng)15 d及1、2、4個(gè)月，B4組喂養(yǎng)15 d，1個(gè)月后懸掛實(shí)驗(yàn)分值低于A組；B2組、B3組、B4組喂養(yǎng)2、3、4個(gè)月后懸掛實(shí)驗(yàn)分值高于B1組；B3組喂養(yǎng)3個(gè)月后、B4組喂養(yǎng)2個(gè)月后懸掛實(shí)驗(yàn)分值高于B2組；B4組喂養(yǎng)1個(gè)月后懸掛實(shí)驗(yàn)分值高于B3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.4 游泳實(shí)驗(yàn)分值 時(shí)間與方法在游泳實(shí)驗(yàn)分值上存在交互作用（P＜0.05）；方法在游泳實(shí)驗(yàn)分值上主效應(yīng)顯著（P＜0.05）；時(shí)間在游泳實(shí)驗(yàn)分值上主效應(yīng)不顯著（P＞0.05）。B1、B2組各時(shí)間點(diǎn)，B3組、B4組喂養(yǎng)15 d及1、2個(gè)月后游泳實(shí)驗(yàn)分值低于A組；B3、B4組喂養(yǎng) 3、4個(gè)月后游泳實(shí)驗(yàn)分值高于B1組；B3、B4組喂養(yǎng)3個(gè)月后游泳實(shí)驗(yàn)分值高于B2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

3 討論

PD是第二大神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病，而采用神經(jīng)毒素MPTP腹腔注射C57BL/6小鼠制備PD模型是較理想的PD模型之一［2］。本研究結(jié)果顯示，A組與B1組喂養(yǎng)15 d～4個(gè)月后爬桿實(shí)驗(yàn)分值、懸掛實(shí)驗(yàn)分值、游泳實(shí)驗(yàn)分值間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明MPTP誘發(fā)C57BL/6小鼠PD模型方法簡(jiǎn)單有效，且制模效果可靠。本研究在第1批制模過程中發(fā)現(xiàn)，50只制模后次日即死亡11只，尸體解剖顯示均為腸壞死，究其原因主要為腹腔注射深度過深，穿刺入腸腔而導(dǎo)致腸壞死致死亡；經(jīng)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、規(guī)范穿刺方法，第2批41只小鼠制模順利完成。因此，MPTP腹腔注射深度及手法直接關(guān)系到制模的成敗。

表2 五組小鼠各時(shí)間點(diǎn)懸掛實(shí)驗(yàn)分值比較（ ±s，分）Table 2 Comparison of traction test scores in the five groups at different time points

表2 五組小鼠各時(shí)間點(diǎn)懸掛實(shí)驗(yàn)分值比較（ ±s，分）Table 2 Comparison of traction test scores in the five groups at different time points

注：與A組比較，aP＜0.05；與B1組比較，bP＜0.05；與B2組比較，cP＜0.05；與B3組比較，dP＜0.05

組別 只數(shù) 喂養(yǎng)15 d后 喂養(yǎng)1個(gè)月后 喂養(yǎng)2個(gè)月后 喂養(yǎng)3個(gè)月后 喂養(yǎng)4個(gè)月后A 組 20 2.8±0.3 3.0±0.3 3.1±0.3 3.0±0.3 3.3±0.3 B1 組 19 1.7±0.6a 1.6±0.6a 1.7±0.6a 1.7±0.6a 1.6±0.7a B2 組 18 1.7±0.5a 2.0±0.5a 2.1±0.7ab 2.3±0.4ab 2.8±0.6b B3 組 20 1.6±0.8a 1.6±0.8a 2.6±0.5ab 2.9±0.4bc 3.0±0.5ab B4 組 20 1.0±0.5a 2.3±0.5ad 2.8±0.4bc 2.7±0.5b 3.0±0.4b F值 F時(shí)間=2.624，F(xiàn)組間=2.233，F(xiàn)交互=2.594 P值 P時(shí)間=0.014，P組間=0.020，P交互=0.011

表3 五組小鼠各時(shí)間點(diǎn)游泳實(shí)驗(yàn)分值比較（ ±s，分）Table 3 Comparison of swimming test scores in the five groups at different time points

表3 五組小鼠各時(shí)間點(diǎn)游泳實(shí)驗(yàn)分值比較（ ±s，分）Table 3 Comparison of swimming test scores in the five groups at different time points

注：與A組比較，aP＜0.05；與B1組比較，bP＜0.05；與B2組比較，cP＜0.05

組別 只數(shù) 喂養(yǎng)15 d后 喂養(yǎng)1個(gè)月后 喂養(yǎng)2個(gè)月后 喂養(yǎng)3個(gè)月后 喂養(yǎng)4個(gè)月后A 組 20 27.6±4.6 28.0±4.0 27.7±3.9 28.5±4.9 29.1±3.8 B1 組 19 16.9±7.2a 17.6±7.6a 18.9±8.0a 16.4±7.2a 17.6±8.1a B2 組 18 16.0±6.5a 18.1±7.4a 20.7±6.6a 17.8±6.6a 21.8±7.9a B3 組 20 17.0±7.1a 17.2±6.9a 20.9±5.9a 24.6±5.2bc 25.0±6.4b B4 組 20 17.0±6.4a 17.6±6.8a 21.4±5.8a 23.8±6.0bc 23.9±7.1b F值 F時(shí)間=1.981，F(xiàn)組間=2.315，F(xiàn)交互=2.049 P值 P時(shí)間=0.052，P組間=0.042，P交互=0.034

PD主要病理特征是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元選擇性變性丟失，主要表現(xiàn)為震顫、肌強(qiáng)直、動(dòng)作遲緩、姿態(tài)平衡障礙等運(yùn)動(dòng)癥狀，但早在1817年JAMES PARKINSON描述PD患者除運(yùn)動(dòng)癥狀外的非運(yùn)動(dòng)癥狀—便秘，但并未受到臨床的足夠重視。腸道菌群失調(diào)可能是導(dǎo)致PD發(fā)生的始動(dòng)因素，細(xì)菌蛋白通過分子模擬機(jī)制、免疫／炎性機(jī)制啟動(dòng)α-syn錯(cuò)誤折疊，并以迷走神經(jīng)為媒介沿腦-腸軸傳播，進(jìn)而導(dǎo)致PD發(fā)生［6］。因此，腸道菌群干預(yù)有可能是治療PD的新視角。PD患者腸道菌群改變主要表現(xiàn)為病原菌增多、有益菌減少，變形菌增多、雙歧桿菌減少，產(chǎn)丁酸菌群（包括瘤胃球菌屬、柔嫩梭菌）減少、刺激炎性反應(yīng)細(xì)菌（包括埃希菌、腸桿菌、擬桿菌、艱難梭狀芽孢桿菌）增多。因此，增加有益菌、減輕炎性反應(yīng)理論上有利于改善PD患者腸道微環(huán)境，進(jìn)而通過腦-腸-微生物軸改善PD患者臨床表現(xiàn)及癥狀［7］。本研究結(jié)果顯示，B2組喂養(yǎng)3、4個(gè)月后爬桿實(shí)驗(yàn)分值高于B1組，B2組喂養(yǎng)2、3、4個(gè)月后懸掛實(shí)驗(yàn)分值高于B1組，但B1組與B2組各時(shí)間點(diǎn)游泳實(shí)驗(yàn)分值間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明益生菌可一定程度改善PD小鼠爬桿、懸掛行為，但對(duì)其游泳行為改善不明顯，并顯示出益生菌治療PD療效的有限性、起效慢等特點(diǎn)，表明腸道微生態(tài)環(huán)境雖可對(duì)PD發(fā)生、發(fā)展起到重要作用，但部分環(huán)節(jié)及影響因素還有待于進(jìn)一步深入研究。

從PD的現(xiàn)代發(fā)病機(jī)制分析，氧自由基與PD發(fā)病密切相關(guān)。PD患者處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，腦黑質(zhì)中固醇類過氧化物較正常人增多10倍，因此，預(yù)先給予抗氧化劑或含巰基的化合物可不同程度地改善PD動(dòng)物行為和生化指標(biāo)改變［8］。抗帕顆粒由熟地黃、山萸肉、紅參、生黃芪、丹參、水蛭、全蝎、僵蠶8味中藥組成，其中熟地可調(diào)節(jié)谷氨酸/γ-氨基丁酸系統(tǒng)遞質(zhì)與受體水平，維持中樞興奮性、抑制氨基酸功能的協(xié)調(diào)平衡，還可降低腦線粒體單胺氧化酶活性，降低體內(nèi)過氧化脂含量，具有一定的抗氧自由基作用［9］；山萸肉能明顯抑制二磷酸腺苷、花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集，同時(shí)可抑制白介素2分泌和表達(dá)；紅參中的人參皂甙具有促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)、清除自由基等作用，并可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)而對(duì)抗多巴胺所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［10］；生黃芪能提高網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，增加抗體分泌細(xì)胞及T、B淋巴細(xì)胞，提高自然殺傷（NK）細(xì)胞活性，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用；丹參中的丹參酮類、丹參素、丹酚酸類化合物等具有較強(qiáng)的抗氧化、抑制炎性因子、抗氧自由基功能［11-12］；水蛭有較強(qiáng)的抗凝與抗血栓形成作用，并可減少血小板源生長(zhǎng)因子等重要炎性因子產(chǎn)生，同時(shí)通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2表達(dá)而起到抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用［13］；僵蠶中的草酸胺具有催眠、抗驚厥作用，并可提高機(jī)體免疫力［14］；全蝎可促進(jìn)乙酰膽堿釋放，并通過調(diào)節(jié)血栓素B2和6-酮-前列腺素F1α平衡，進(jìn)而起到保護(hù)血管內(nèi)皮功能、預(yù)防血栓形成的作用［15］，因此抗帕顆粒具有抗氧化應(yīng)激、抗氧自由基及提高機(jī)體免疫力等作用，推測(cè)這種抗氧化作用很可能通過改善腸道微生態(tài)、保護(hù)神經(jīng)元等機(jī)制在PD治療中起重要作用。

本研究結(jié)果顯示，B3組喂養(yǎng)2、3、4個(gè)月后爬桿實(shí)驗(yàn)分值、懸掛實(shí)驗(yàn)分值均高于B1組，表明抗帕顆粒對(duì)PD小鼠模型的行為學(xué)具有良好的改善作用，同時(shí)顯示出抗帕顆粒起效慢，用藥2～3個(gè)月方可見效，這與中醫(yī)中藥的作用特點(diǎn)有關(guān)；此外，B3組喂養(yǎng)3、4個(gè)月后游泳實(shí)驗(yàn)分值高于B1組，可見抗帕顆粒對(duì)PD模型小鼠游泳動(dòng)作改善需要更持久、更足量的治療，究其原因?yàn)橛斡緞?dòng)作對(duì)肢體的協(xié)調(diào)性要求更高，因此相應(yīng)的治療要求更高。另外，本研究結(jié)果還顯示，B3、B4組喂養(yǎng)2、4個(gè)月后爬桿實(shí)驗(yàn)分值高于B2組，B3組喂養(yǎng)3個(gè)月后、B4組喂養(yǎng)2個(gè)月后懸掛實(shí)驗(yàn)分值高于B2組，B3、B4組喂養(yǎng)3個(gè)月后游泳實(shí)驗(yàn)分值高于B2組，表明抗帕顆粒對(duì)PD模型小鼠行為學(xué)的干預(yù)較益生菌有一定優(yōu)勢(shì)，但在應(yīng)用過程中應(yīng)注意其起效慢、足量、足程等問題，因其作用的緩和性尤其是益生菌對(duì)PD模型小鼠游泳實(shí)驗(yàn)改善有限，故需考慮聯(lián)合使用多巴制劑，以達(dá)到減慢神經(jīng)元變性的目的，而聯(lián)合干預(yù)較抗帕顆粒單藥干預(yù)并未顯現(xiàn)更大的療效，有待于在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)與臨床中深入、細(xì)化研究。

綜上所述，益生菌、抗帕顆粒對(duì)PD模型小鼠行為學(xué)均具有良好的改善作用，且抗帕顆粒較益生菌有一定優(yōu)勢(shì)，而二者聯(lián)合并未有明顯優(yōu)勢(shì)；但本研究納入樣本量小、干預(yù)時(shí)間短，后續(xù)仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、延長(zhǎng)干預(yù)時(shí)間探尋更客觀的行為學(xué)觀測(cè)方法。

作者貢獻(xiàn)：趙曉暉進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，論文的修訂，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；王永兵、趙曉暉進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；奚峰、張麗婭、劉慧琴進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；蔣曉真、楊娟、李剛進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；王永兵負(fù)責(zé)撰寫論文；蔣曉真負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。