右美托咪定對老年膿毒癥大鼠Shh信號通路及認(rèn)知功能的影響研究

劉鐵軍，董曉柳，張樹波，趙曉晶，段立昆，李紅霞

膿毒癥（sepsis）是臨床上危重癥之一，有研究表明，膿毒癥患者可長期伴有不同程度的認(rèn)知障礙［1］，可能是因患者的血-腦脊液屏障（blood-brain barrier，BBB）結(jié)構(gòu)和功能被破壞。BBB有賴于星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的膠質(zhì)-血管耦合［2］，可通過Shh-Gli經(jīng)典信號通路誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMEC）高表達(dá)后緊密連接蛋白，從而促進(jìn)BBB穩(wěn)定［3］。近年來，星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的Shh因子在BBB特征中的誘導(dǎo)作用備受關(guān)注。Shh信號通路主要由分泌型糖蛋白配體Shh、跨膜蛋白受體Ptc、跨膜蛋白Smo、核轉(zhuǎn)錄因子蛋白Gli及下游靶基因組成［4］。右美托咪定是一種高選擇性的α2受體激動劑，通過激活藍(lán)斑核α2腎上腺素受體，產(chǎn)生劑量依賴性鎮(zhèn)靜作用，由于其鎮(zhèn)靜效果模擬“自然睡眠”［5］，是臨床上安全有效的麻醉輔助用藥［6］，其也可透過BBB，對膿毒癥大鼠具有保護(hù)作用［7］，但其對膿毒癥所致認(rèn)知障礙是否有改善的研究報道較少。本研究旨在探討右美托咪定對老年膿毒癥大鼠Shh信號通路及認(rèn)知功能的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 2019年1—9月，選取健康雄性SD大鼠54只，月齡18～20月，體質(zhì)量550～600 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物實(shí)驗(yàn)遵循國際動物倫理學(xué)要求。大鼠由專人飼養(yǎng)，環(huán)境通風(fēng)良好、恒溫恒濕，可自由進(jìn)食飲水，嚴(yán)格控制光照周期。采用隨機(jī)數(shù)字表法將所有大鼠隨機(jī)分為Sham組、CLP組、Dex組，每組18只。

1.2 模型制備

1.2.1 Sham組 Sham組大鼠用2%戊巴比妥鈉0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉，仰臥固定大鼠，在腹部正中處依次切開皮膚、腹白線，切口約1.5 cm，開腹后分離出盲腸后，用4-0縫線縫合腹壁各層，縫合后以100 ml/kg的0.9%氯化鈉溶液皮下注射進(jìn)行液體復(fù)蘇。于術(shù)后6 h腹腔注射0.9%氯化鈉溶液10 μg/kg。

1.2.2 CLP組 CLP組大鼠參照文獻(xiàn)［8］采用盲腸結(jié)扎穿孔法制備大鼠膿毒癥模型，用2%戊巴比妥鈉0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定大鼠，在腹部正中處依次切開皮膚、腹白線，切口約1.5 cm，開腹后分離出盲腸并牽拉出腹腔，在距盲腸尖端約1/2處以2-0尼龍縫線結(jié)扎，注意避免結(jié)扎回腸及盲腸系膜血管，在結(jié)扎處與盲腸末端中點(diǎn)處用18 G無菌注射器針頭從系膜緣向?qū)ο的ぞ壸?次貫通穿孔，擠出約0.3 ml腸內(nèi)容物，后將盲腸連同擠出的腸內(nèi)容物一同回納腹腔，用4-0縫線縫合腹壁各層，縫合后以100 ml/kg的0.9%氯化鈉溶液皮下注射進(jìn)行液體復(fù)蘇。于術(shù)后6 h腹腔注射0.9%氯化鈉溶液10 μg/kg。

1.2.3 Dex組 Dex組大鼠于膿毒癥模型制備后6 h腹腔注射右美托咪定10 μg/kg，模型制備同CLP組。

1.3 行為學(xué)檢測 采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)［9］評價老年大鼠認(rèn)知功能，具體如下：模型制備前所有大鼠進(jìn)行水迷宮適應(yīng)性訓(xùn)練1 d，造模后進(jìn)行4 d定位航行實(shí)驗(yàn)：每天同一時間將大鼠面朝水池分別從4個象限固定位置放入水中，讓其尋找平臺位置，找到平臺時間即為逃避潛伏期，若120 s內(nèi)大鼠找到平臺，則記錄其逃避潛伏時間及運(yùn)動軌跡，若120 s未找到平臺，則引導(dǎo)其找到平臺，并停留10 s，加深記憶；第5天進(jìn)行測試：移除平臺，限時120 s，記錄逃避潛伏期、穿過平臺次數(shù)及處于平臺所在象限時間。

1.4 腦組織含水量 采用隨機(jī)數(shù)字表法從Sham組、CLP組、Dex組中各選取6只大鼠，剪除大鼠術(shù)區(qū)鼠毛并消毒，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，經(jīng)左心室插管至主動脈，在右心耳剪一開口，用500 ml PBS沖洗全身血液循環(huán)，當(dāng)右心耳流出清亮液體后斷頭，剝離出完整腦組織后迅速取出大鼠腦組織。將大鼠腦組織分成3部分，分別為左側(cè)大腦半球、右側(cè)大腦半球及小腦，將其置于錫紙上做好標(biāo)記迅速稱量各部分腦組織濕重（W），后將腦組織置于恒溫干燥箱內(nèi)，100 ℃干燥24 h，稱量各部分腦組織干重（D），計算腦組織含水量=（W-D）/W×100%。

1.5 海馬組織Shh、Gli-1及Ptc含量 采用隨機(jī)數(shù)字表法從Sham組、CLP組、Dex組中再各選取6只大鼠，剪除大鼠術(shù)區(qū)鼠毛并消毒，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，經(jīng)左心室插管至主動脈，在右心耳剪一開口，用500 ml PBS沖洗全身血液循環(huán)，當(dāng)右心耳流出清亮液體后斷頭，剝離出完整腦組織后，冰上剝離取出海馬組織，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測三組大鼠海馬組織Shh、Gli-1及Ptc含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 海馬組織ZO-1、Claudin-5相對表達(dá)量 采用Western blot法檢測海馬組織ZO-1、Claudin-5相對表達(dá)量，Sham組、CLP組、Dex組中各剩余6只大鼠，剪除大鼠術(shù)區(qū)鼠毛并消毒，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，經(jīng)左心室插管至主動脈，在右心耳剪一開口，用500 ml PBS沖洗全身血液循環(huán)，當(dāng)右心耳流出清亮液體后斷頭，剝離出完整腦組織后，冰上剝離取出海馬組織，加入三去污劑蛋白質(zhì)裂解緩沖液，4 ℃ 2 000 r/min離心30 min（離心半徑10 cm），留取上清液，獲得總蛋白，以二喹啉甲酸（BCA）法檢測蛋白含量。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）：加樣、電泳分離，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后分別加入一抗：兔抗ZO-1抗體（稀釋濃度為1：500，Abcam公司）、兔抗Claudin-5抗體（稀釋濃度為1：1 000，Abcam公司），4 ℃孵育過夜。次日復(fù)溫30 min后，TBST洗膜10 min，重復(fù)3次，分別加入相應(yīng)的二抗（稀釋濃度為1：2 000，Abcam公司），放在搖床上輕搖1 h，TBST洗膜10 min，重復(fù)3次。暗室內(nèi)將ECL發(fā)光試劑盒（上海喬羽生物科技有限公司）中的A、B液混合成ECL混合液（體積比為1：1），并滴在PVDF膜的蛋白面上，顯影成像，應(yīng)用Quantity One 4.4.0分析軟件分析各組相對灰度值，即為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、處于平臺所在象限時間 三組大鼠用藥后逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、處于平臺所在象限時間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Sham組比較，CLP組、Dex組大鼠用藥后逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少，處于平臺所在象限時間縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與CLP組比較，Dex組大鼠用藥后逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增多，處于平臺所在象限時間長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

表1 三組大鼠用藥后逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、處于平臺所在象限時間比較（±s）Table 1 Comparison of escape incubation period，times of crossing platform and duration of keeping platform quadrant in the three groups after medication

表1 三組大鼠用藥后逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、處于平臺所在象限時間比較（±s）Table 1 Comparison of escape incubation period，times of crossing platform and duration of keeping platform quadrant in the three groups after medication

注：ham組大鼠僅行剖腹探查術(shù)，CLP組大鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥模型，Dex組大鼠于膿毒癥模型制備后6 h腹腔注射右美托咪定；與Sham組比較，aP＜0.05，與CLP組比較，bP＜0.05

（s）穿越平臺次數(shù)（次）處于平臺所在象限時間（s）Sham 組 18 22.6±1.4 8.9±1.0 65.7±6.8 CLP 組 18 40.8±3.7a 2.4±0.5a 36.2±5.1a Dex組 18 34.1±2.5ab 4.0±0.8ab 48.4±6.3ab F值 69.648 109.247 40.027 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001組別 只數(shù) 逃避潛伏期

2.2 腦組織含水量 Sham組大鼠用藥后腦組織含水量為（0.73±0.02）%，CLP組大鼠為（0.87±0.04）%，Dex組大鼠為（0.78±0.03）%。三組大鼠用藥后腦組織含水量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=31.245，P＜0.001）；與Sham組比較，CLP組、Dex組大鼠用藥后腦組織含水量多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與CLP組比較，Dex組大鼠用藥后腦組織含水量少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 海馬組織Shh、Gli-1、Ptc含量 三組大鼠用藥后海馬組織Shh、Gli-1、Ptc含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Sham組比較，CLP組、Dex組大鼠用藥后海馬組織Shh、Gli-1含量降低，Ptc含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與CLP組比較，Dex組大鼠用藥后海馬組織Shh、Gli-1含量升高，Ptc含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.4 海馬組織ZO-1、Claudin-5相對表達(dá)量 三組大鼠用藥后海馬組織ZO-1、Claudin-5相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Sham組比較，CLP組、Dex組大鼠用藥后海馬組織ZO-1、Claudin-5相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與CLP組比較，Dex組大鼠用藥后用藥后ZO-1、Claudin-5相對表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

表2 三組大鼠用藥后海馬組織Shh、Gli-1、Ptc含量比較（ ±s）Table 2 Comparison of contents of Shh，Gli-1 and Ptc in hippocampus in the three groups after medication

表2 三組大鼠用藥后海馬組織Shh、Gli-1、Ptc含量比較（ ±s）Table 2 Comparison of contents of Shh，Gli-1 and Ptc in hippocampus in the three groups after medication

注：與Sham組比較，aP＜0.05，與CLP組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) Shh Gli-1 Ptc Sham 組 6 0.74±0.03 0.78±0.05 0.45±0.02 CLP 組 6 0.49±0.02a 0.55±0.03a 0.71±0.05a Dex組 6 0.65±0.02ab 0.69±0.04ab 0.52±0.04ab F值 169.762 48.361 72.509 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表3 三組大鼠用藥后海馬組織ZO-1、Claudin-5相對表達(dá)量比較（±s）Table 3 Comparison of relative protein expression quantity of ZO-1 and Claudin-5 in hippocampus in the three groups after medication

表3 三組大鼠用藥后海馬組織ZO-1、Claudin-5相對表達(dá)量比較（±s）Table 3 Comparison of relative protein expression quantity of ZO-1 and Claudin-5 in hippocampus in the three groups after medication

注：與Sham組比較，aP＜0.05，與CLP組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) ZO-1 Claudin-5 Sham 組 6 0.41±0.06 0.29±0.04 CLP 組 6 0.09±0.02a 0.05±0.01a Dex組 6 0.27±0.05ab 0.18±0.02ab F值 71.268 123.716 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

膿毒癥是一種嚴(yán)重且致命的疾病，而腦功能的損傷是增加病死率的原因之一，其主要病理特點(diǎn)是腦內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接功能出現(xiàn)障礙，BBB被破壞，進(jìn)而使全身炎性反應(yīng)的神經(jīng)毒性遞質(zhì)進(jìn)入大腦，造成膿毒癥相關(guān)性腦病，可表現(xiàn)為學(xué)習(xí)及記憶能力下降、注意力減弱、生活質(zhì)量降低等。Claudin-5、ZO-1是BBB中主要的緊密連接蛋白，對維持BBB功能及防止腦水腫至關(guān)重要［10］。右美托咪定是臨床上效果確切的麻醉輔助用藥，可穿過BBB激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異性跨膜α2腎上腺能受體，從而發(fā)揮生理效應(yīng)。目前右美托咪定已被廣泛應(yīng)用于膿毒癥患者。

Hedgehog（Hh）基因最先在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)，隨后在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)，Hh家族信號分子包括Shh、Indian hedgehog（Ihh） 和 desert hedgehog（Dhh）［11］， 而 其中作為成形的Shh及其信號通路的研究報道較多。Shh信號通路受體Ptc與配體Shh直接結(jié)合，對Hh信號起負(fù)調(diào)控作用，而Smo是Hh信號傳遞所必需的受體，對Hh信號起正調(diào)控作用。正常情況下，Ptc抑制Smo活性從而阻止下游Gli進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，而當(dāng)Ptc和Hh信號結(jié)合后會解除對Smo的抑制，促使Gli與某些因子形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。近年來，許多學(xué)者已在多種疾病模型中或臨床中進(jìn)行Shh信號通路研究，發(fā)現(xiàn)Shh信號通路不僅參與了胚胎發(fā)育［12］、器官形成［13］、腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程［14］，還在神經(jīng)修復(fù)［15］等方面發(fā)揮重要作用。有研究表明，在急性缺血性腦卒中動物模型中發(fā)現(xiàn)Shh含量上調(diào)［16］，腦水腫加重［17］；而在腦室內(nèi)注射人重組Shh后，BBB通透性降低，腦水腫減輕［18］。故Shh信號通路與維持BBB的完整性密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，與Sham組比較，CLP組、Dex組用藥后大鼠逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少，處于平臺所在象限時間縮短；與CLP組比較，Dex組大鼠用藥后逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增多，處于平臺所在象限時間長；說明膿毒癥可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)認(rèn)知障礙，且右美托咪定可有效改善膿毒癥大鼠的認(rèn)知功能。本研究結(jié)果顯示，與Sham組比較，CLP組、Dex組大鼠用藥后腦組織含水量增多，海馬組織ZO-1、Claudin-5相對表達(dá)量降低，而與CLP組比較，Dex組大鼠用藥后腦組織含水量減少，海馬組織ZO-1、Claudin-5相對表達(dá)量升高，說明膿毒癥可導(dǎo)致大鼠BBB破壞、通透性增加，而右美托咪定可有效降低膿毒癥大鼠的BBB通透性。本研究結(jié)果顯示，與Sham組比較，CLP組、Dex組大鼠用藥后海馬組織Shh、Gli-1含量降低，Ptc含量升高，而與CLP組比較，Dex組大鼠用藥后海馬組織Shh、Gli-1含量升高，Ptc含量降低，提示Shh信號通路參與了膿毒癥的發(fā)病過程，膿毒癥可抑制Shh信號通路的激活，而右美托咪定可有效激活Shh信號通路，分析其機(jī)制可能為：右美托咪定可透過BBB進(jìn)入腦內(nèi)，升高Shh含量，解除對Smo的抑制，使Smo的空間構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)一步激活其下游靶基因及Gli-1進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)從而引發(fā)轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮Shh信號介導(dǎo)的通路，從而降低BBB通透性、改善認(rèn)知功能。

綜上所述，右美托咪定可有效改善老年膿毒癥大鼠認(rèn)知功能，降低BBB通透性，其作用機(jī)制可能與激活Shh信號通路有關(guān)，后續(xù)有待開展相關(guān)人群研究以進(jìn)一步驗(yàn)證右美托咪定對老年膿毒癥患者認(rèn)知功能的影響。

作者貢獻(xiàn)：劉鐵軍、董曉柳進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計；劉鐵軍、趙曉晶進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；段立昆進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；張樹波進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及文章的質(zhì)量控制及審校；張樹波、李紅霞進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理；董曉柳進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；劉鐵軍負(fù)責(zé)撰寫論文，對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。