神經(jīng)重癥監(jiān)護(hù)室中肺炎克雷伯菌的流行病學(xué)特征研究

劉妍，張萍淑，2，喬思佳，李佳慧，鄭慧，元小冬，2

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是引發(fā)各種 類型醫(yī)院感染和社區(qū)感染的主要病原菌，其在病房環(huán)境中具有較強(qiáng)的傳播和定植能力［1-2］。神經(jīng)重癥監(jiān)護(hù)室（neurological intensive care unit，NICU）患者多伴有意識(shí)障礙，因其病情危重并接受侵入性操作等而成為院內(nèi)感染的高危人群，其中KP是NICU患者院內(nèi)感染的常見致病菌［3-4］。近年臨床感染控制部門常采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）技術(shù)、多位點(diǎn)序列分型（MLST）等檢測(cè)KP，其中PFGE技術(shù)是檢測(cè)KP同源性的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本研究通過PFGE技術(shù)檢測(cè)NICU感染患者和病房環(huán)境中分離KP間的同源性，進(jìn)而了解NICU中KP傳播途徑，指導(dǎo)NICU制定科學(xué)合理的環(huán)境消毒措施，切斷其傳播途徑，有效控制KP傳播，降低NICU患者KP感染發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015—2018年在華北理工大學(xué)附屬開灤總醫(yī)院NICU住院的KP感染患者93例，均符合《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)（試行）》［5］中的KP感染診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）體溫≥38.0 ℃且持續(xù)時(shí)間≥2 d；（2）血常規(guī)檢查顯示白細(xì)胞計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)目異常改變，影像學(xué)檢查結(jié)果示肺部炎性浸潤(rùn)性改變；（3）存在呼吸道急性炎癥，并伴惡心嘔吐、腹痛/腹瀉等消化系統(tǒng)癥狀；（4）明顯尿道刺激征、下腹觸痛、腎區(qū)叩擊痛，且尿常規(guī)檢查示白細(xì)胞計(jì)數(shù)異常升高（男性≥5個(gè)/高倍視野，女性≥10個(gè)/高倍視野）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）因流行性感冒、過敏及其他急性傳染病等非感染因素導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)炎癥表現(xiàn)者；（2）因急性傳染病等其他疾病引起的發(fā)熱、惡心嘔吐、腹瀉等感染癥狀者。所有患者中，男56例、女37例，平均年齡（69.4±2.4）歲。本研究經(jīng)華北理工大學(xué)附屬開灤總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，且所有患者對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 KP感染患者KP采集 留取KP感染患者標(biāo)本（包括痰、血、尿、便、分泌物等）進(jìn)行KP檢測(cè)。

1.2.2 床單位環(huán)境KP采集 在患者確診KP感染24 h內(nèi)對(duì)其床單位環(huán)境（包括病床周圍空氣、枕頭、被子、床頭柜等）進(jìn)行KP檢測(cè)并采集標(biāo)本。

1.2.3 NICU病房環(huán)境KP采集 NICU病房分為大房間（6人間）、小房間（2人間），分別于每個(gè)月第2、4周周二上午9：00～10：00對(duì)大、小房間的病房環(huán)境進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)并采集標(biāo)本。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)及菌株鑒定，并將分離的KP菌株置于-20 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 KP同源性檢測(cè)方法 將KP感染患者及其床單位環(huán)境、NICU病房環(huán)境中分離的KP菌株接種于中國(guó)藍(lán)培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基置于35 ℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培育24 h，而后經(jīng)過KP DNA的提取、細(xì)菌的膠塊包埋、細(xì)胞的裂解、膠塊的清洗、膠塊內(nèi)DNA的酶切、制膠與上樣等步驟后進(jìn)行PFGE，最后采集圖像并保存。PFGE圖像數(shù)據(jù)采用BioNumerics（Version 7.1，Applied maths，Inc.）軟件包進(jìn)行處理，識(shí)別圖像條帶（出現(xiàn)不同條帶即判定為成功分型），不同菌株條帶相似性系數(shù)用Dice系數(shù)（Dice coefficients，SD）表示，根據(jù)每?jī)蓚€(gè)圖像間的相似性系數(shù)采用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA）進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建聚類樹。以相似度為100%為同一克隆株，相似度≥80%為同一流行克隆株作為標(biāo)準(zhǔn)［6］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Excel 2007軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行描述性分析。

2 結(jié)果

2.1 KP采集結(jié)果 93例KP感染患者中，分離出KP 94株；患者所在床單位環(huán)境分離出KP 13株，包括病床周圍空氣8株、患者被子2株、患者枕頭1株、患者床頭柜1株、空氣1株。KP同源性PFGE聚類分析見圖1。

2.2 KP感染患者及其床單位環(huán)境的關(guān)系 KP感染患者及其床單位環(huán)境分離的107株KP中，僅4株（菌株編號(hào)分別為1508、1518、1711、1810）PFGE圖像條帶未出現(xiàn)，故103株成功分型并可分為85個(gè)型別。聚類分析結(jié)果顯示，KP感染患者與其床單位環(huán)境同源性100%的KP 15組，其中23例KP感染患者KP 24株，其中1例咽拭子/血、痰培養(yǎng)分別培養(yǎng)出不同的KP，23例患者基本情況見表1，KP感染患者及其床單位環(huán)境同源性為100%的KP菌株情況見表2；床單位環(huán)境KP 9株。

表1 NICU同源性100%的KP感染患者基本情況（n=23）Table 1 Basic situation of patients with KP infection with 100% homology of NICU

2.3 同源性100%的KP感染患者入住NICU時(shí)間間隔 同源性100%的15組KP感染患者中，第1組患者入住NICU時(shí)間間隔22 d，第2組為29 d，第3組為31 d，第4組為患者與其周圍空氣，第5組為患者與小房間空氣，第6組為15 d，第7組為3 d，第8組為117 d，第9組為同一患者痰培養(yǎng)、咽拭子檢出的KP；第10組為患者與其枕頭；第11組為95 d，第12組為8 d，第13組為10 d，第14組為患者周圍空氣與床頭柜，第15組為患者周圍空氣與被子。

3 討論

NICU患者是醫(yī)院感染的高危人群，而KP是導(dǎo)致感染的主要致病菌［7］。PFGE是研究分子流行病學(xué)的一種技術(shù)，通過分析菌株間同源性以較好地了解菌株間的親緣關(guān)系，有助于尋找疾病傳播途徑，便于制定預(yù)防交叉感染的有效策略。研究表明，同一型別菌株可能存在流行病學(xué)關(guān)聯(lián)［8-9］。

圖1 NICU KP同源性PFGE聚類分析圖Figure 1 KP homology PFGE cluster analysis chart in NICU

PFGE技術(shù)作為同源性檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，是目前臨床研究細(xì)菌間相關(guān)性應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，可用于研究菌株間的遺傳差異、追蹤傳染源、進(jìn)行分子流行病學(xué)研究等［10］。PFGE技術(shù)先提取菌株染色體，再用瓊脂塊進(jìn)行包埋，細(xì)菌染色體用特異性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，由于酶切后的染色體DNA大小不同，因此其在交替改變的電場(chǎng)中電泳速度也不同，故表現(xiàn)為不同的條帶［11］，通過比較條帶的數(shù)目、位置可以了解菌株間的同源性。本研究通過收集NICU中KP，采用PFGE技術(shù)分析菌株間的同源性，進(jìn)一步了解NICU中KP的流行病學(xué)特征，以為NICU重癥患者KP感染的防控提供科學(xué)合理的理論指導(dǎo)。

本研究結(jié)果顯示，KP感染患者與其床單位環(huán)境同源性100%的KP 15組，2018年2例感染患者1819、1820（P90、P91）和其中1例感染患者周圍空氣中檢出的KP 1824（PA9）為同一克隆株，這2例患者入住NICU時(shí)間間隔為22 d；2018年2例感染患者1814、1817（P85、P88）入住NICU時(shí)間間隔為29 d；2018年2例感染患者1806、1807（P77、P78）入住NICU時(shí)間間隔為31 d；2015年2例感染患者1526、1528（P26、P28）與其中1例感染患者周圍空氣中檢出的KPB1（P26B）為同一克隆株，這2例患者入住NICU時(shí)間間隔為15 d；2015年2例感染患者1513、1501（P13、P1）入住NICU時(shí)間間隔為3 d；2015年2例感染患者1520、1525（P20、P25）入住NICU時(shí)間間隔為117 d；2016年3例感染患者1603、1610、1619（P32、P39、P48）入住NICU時(shí)間間隔為95 d；2016年2例感染患者1612、1613（P41、P42）入住NICU的時(shí)間間隔為8 d；2016年2例感染患者1623、1624（P52、P53）入住NICU時(shí)間間隔為10 d；2017年1例感染患者1712（P66）與其周圍空氣中1719（PA7）檢出的KP為同一克隆株；2015年1例感染患者1527（P27）與小房間空氣中A3（PAX）檢出的KP為同一克隆株；2015年同一感染患者痰培養(yǎng)1521T（P21T）、咽拭子1521Y（P21Y）檢出的KP為同一克隆株；2015年1例感染患者1529（P29）和其枕頭上Z1（P29Z）檢出的KP為同一克隆株；2015年1例感染患者周圍空氣A2（PZA）和床頭柜T1（PZT）中檢出的KP為同一克隆株，2015年1例感染患者周圍空氣A4（PA4）和被子中B2（PB2）檢出的KP為同一克隆株。本課題組既往研究結(jié)果表明，KP是NICU的主要致病菌，具有極強(qiáng)的定植和傳播能力，并對(duì)NICU環(huán)境微生物定植分布特征及影響因素與醫(yī)院感染的關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)研究［3，12］。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，患者感染的KP與其環(huán)境中檢出的KP同源性為100%，表明KP可通過空氣、枕頭、被子等途徑導(dǎo)致患者感染。另外，本研究結(jié)果還顯示，患者入院時(shí)間不同，但檢出KP可為同一克隆株，表明KP可在環(huán)境中長(zhǎng)期定植，且最長(zhǎng)可在NICU環(huán)境中定植117 d，因此為病房環(huán)境有效消毒極其重要。

同源性100%的KP中共包括23例KP感染患者KP 24株，床單位環(huán)境KP 9株，同源性100%患者入住NICU最長(zhǎng)時(shí)間間隔117 d，表明KP可在患者枕頭、被子、床頭柜等床單位環(huán)境中定植，并可在病房環(huán)境中生存長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月左右，進(jìn)一步造成其他住院患者感染，因此要對(duì)KP醫(yī)院感染高風(fēng)險(xiǎn)的患者進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)，實(shí)施嚴(yán)格的消毒隔離措施，臨床診療過程中要增強(qiáng)對(duì)重癥易感患者的管理［13-15］，加強(qiáng)醫(yī)院感染監(jiān)測(cè)、強(qiáng)化病房環(huán)境的消毒，切斷KP的傳播途徑［16-18］，才能有效控制NICU中患者KP感染［19-20］。研究表明，空氣傳播是患者感染KP最常見途徑，住院時(shí)間越長(zhǎng)，患者感染率越大，使用抗生素的時(shí)間越長(zhǎng)、種類越多，且易合并其他細(xì)菌感染。因此，在臨床工作中可針對(duì)其可能的危險(xiǎn)因素加強(qiáng)預(yù)防措施和操作過程管理、規(guī)范抗菌藥物臨床使用，對(duì)KP感染患者早發(fā)現(xiàn)早隔離并給予合理的抗感染治療，進(jìn)而預(yù)防和減少KP傳播［21-22］。

綜上所述，KP是NICU常見致病菌，而空氣傳播是其主要傳播途徑，并可在NICU空氣中定植4個(gè)月左右，且枕頭、被子等也可傳播KP，因此加強(qiáng)感染患者和病房環(huán)境監(jiān)測(cè)，及時(shí)消毒以切斷KP傳播途徑，有效防控其傳播與流行；但本研究?jī)H針對(duì)NICU患者，且為單中心研究，今后可聯(lián)合冠心病重癥監(jiān)護(hù)室（CCU）、呼吸重癥監(jiān)護(hù)室（RCU）等科室及多中心共同研究，以更全面地了解KP定植及其傳播特征。

作者貢獻(xiàn)：劉妍、張萍淑進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，論文的修訂；元小冬進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；劉妍、喬思佳、李佳慧、鄭慧進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；劉妍進(jìn)行結(jié)果分析與解釋，撰寫論文；張萍淑負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。