大鼠胚胎內注射hUCMSCs在肝內存活和肝分化研究

鄢東海，向雪萍，逄永成，譚顯慶，鄭開恢，田 川，李自安，王 強，龐榮清*

(1.聯勤保障部隊第九二〇醫院細胞生物治療中心，干細胞與免疫細胞生物醫藥技術國家地方聯合工程實驗室，昆明 650032；2.巴東縣人民醫院，湖北 巴東 444300；3.巴東縣中醫醫院，湖北 巴東 444300)

人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSCs)易于取材、細胞增殖活性強，具有免疫調節特性等優點，使其成為再生醫學和組織工程領域應用十分廣泛的細胞源，且在臨床可治療諸多疾病，這或許是細胞治療[1-2]新時代的開端。但是，植入細胞在體內如何靶向遷移、定向分化等研究還不明確。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因轉染標記是常用的體內示蹤技術方法，用GFP標記人胎盤來源的間充質干細胞可在體外分化成肝細胞[3]。胚胎期屬于個體發育的特殊時期，胚胎期注射hUMSCs能否向肝分化具有重要的意義，可為轉化醫學提供更充足的理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

所用動物為SPF級SD大鼠。2只雄性SD大鼠和5只雌性SD大鼠，體重180～220 g，70～84 d日齡，均購于昆明醫科大學[SCXK(滇)K2015-0002]，飼養于第九二〇醫院屏障系統環境動物實驗室[SYXK(軍)2017-0052]。經第九二〇醫院倫理委員會的批準(2017027)，使用實驗動物時嚴格按照3R原則給予人道關懷。

1.1.2 細胞

人臍帶間充質干細胞(hUCMSCs)由第九二〇醫院細胞生物治療中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

新西蘭熱滅活小牛血清(商品貨號∶26170043)、DMEM/F-12培養基(商品貨號∶C11330500BT)和0.25%胰蛋白酶溶液(商品貨號∶252000-056)均購自美國Gibico公司；攜帶GFP基因的慢病毒購自吉滿生物公司(商品編號∶GM100101-2)；免疫組織化學染色用單抗Rabbitanti-human HNF4α(商品編號∶ab181604)、Rabbitanti-human HNF3β(商品編號∶ab180710)和Rabbitanti-human ALB(商品貨號∶ab2073227)均購自英國Abcam公司。Heal Force CO2細胞培養箱購自上海力申科學儀器有限公司；IX 70-121倒置相差顯微鏡購自Olympus公司；正置熒光顯微鏡NIKON ECLIPSE C1、成像系統NIKON DS-U3均購自日本尼康公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 hUCMSCs的GFP轉染標記

根據說明書并參照慢病毒轉染的技術方法[4]標記hUCMSCs，即將鑒定合格的P3代hUCMSCs轉移到175 cm的細胞培養瓶中靜置培養24 h后，按轉染復數(multiplicity of infection MOI)MOI＝50的劑量在每瓶細胞中滴加攜帶GFP慢病毒液共培養72 h，在熒光倒置顯微鏡下觀察，消化并收集標記的細胞，即GFP-hUCMSCs用于傳代培養或懸浮于生理鹽水中制成1×107cells/mL的單細胞懸液避光保存備用。

1.3.2 SD大鼠胚胎注射GFP-hUCMSCs

按雄雌比1∶2和1∶3比例合籠，早、中、晚觀察雌鼠陰栓情況，發現陰栓計為孕齡0.5 d，并分籠精心喂養，發現陰栓第15天時行胚胎注射。注射方法為切開孕鼠盆腔腹壁，暴露孕鼠“Y”字形雙子宮，無菌操作，保持胚胎濕潤，透過透明子宮壁給每只胎鼠上腹部快速注射0.1 mL含106個GFP-hUCMSCs。注射相同體積生理鹽水的同齡胎鼠作為陰性對照。注射完畢后，分層縫合切口，消毒后將孕鼠單獨放在有無菌敷料的鼠籠待其蘇醒，精心飼養觀察，待胎鼠出生后隨機分組實驗。

1.3.3 肝組織冰凍切片GFP陽性細胞檢測

新生大鼠出生45 d、75 d、120 d時，手術切取少許肝組織。制作冰凍切片，滴加DAPI染色后直接在正置熒光顯微鏡觀察GFP陽性細胞的分布并拍照。

1.3.4 肝組織中人肝細胞特異蛋白免疫組織化學染色分析檢測

新生大鼠出生45 d、75 d、120 d時，隨機切取適量肝組織，迅速用質量分數4%多聚甲醛固定后制石蠟切片，經脫蠟水化、抗原修復。抗體孵育:一抗孵育(Rabbit-anti-human HNF4α、Rabbit-anti-human HNF3β和Rabbit-anti-human ALB)，在濕盒內4℃孵育過夜，PBS緩沖液(0.01 mol/L)漂洗3次；二抗孵育每張滴加抗兔生物素100μL，常溫孵育1 h，PBS緩沖液(0.01 mol/L)洗滌3次，每次3 min，每張滴加HRP標記鏈親和素50μL，常溫孵育10 min。PBS緩沖液(0.01 mol/L)清洗3次，每次3 min，每張滴加DAB顯色液50μL，常溫孵育10 min，然后用自來水沖洗約10 min，蘇木素復染2 min，并加鹽酸酒精分化2 s，自來水洗凈染液。脫水、透明以及封片，最后用顯微鏡觀察并拍照。

2 結果

2.1 GFP轉染標記hUCMSCs

按轉染復數MOI＝50的劑量，將鑒定合格的P3代細胞與攜帶GFP慢病毒液共培養72 h。在熒光倒置顯微鏡下可清楚看到大量貼壁生長的細胞呈現較亮的綠色熒光信號(見圖1A)，未加入GFP慢病毒液共培養的對照組細胞觀察不到綠色熒光表達(見圖1B)。

2.2 各組肝中GFP陽性細胞的分布情況

胚胎期注射GFP-hUCMSCs的實驗組大鼠肝組織制作冰凍切片，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光信號的存在。其中，45 d較多，個別鼠特別多(圖2A、2B)，75 d減少(圖2C)，120 d只可見極少量熒光信號(圖2D)，對照組則觀察不到GFP陽性細胞分布(圖2E)。

注:A:與GFP慢病毒共培養的hUCMSCs；B:沒有共培養的對照hUCMSCs。圖1 轉染GFP基因標記的hUCMSCsNote.A，hUCMSCs co-cultured with GFP lentivirus.B，Control hUCMSCs without co-culture.Figure 1 Transfection of GFP gene-tagged hUCMSCs

注:A:45 d組1只大鼠GFP陽性分布較多；B:45 d組大鼠GFP陽性分布；C:75 d大鼠GFP陽性分布；D:120 d GFP陽性分布；E:陰性對照組。圖2 不同組SD大鼠肝組織冰凍切片內GFP信號觀察Note.A，The GFP positive distribution of 1 rat in the 45 d group was more.B，the positive distribution of GFP in the 45 d group.C，the positive distribution of GFP in the 75 d rat.D，120 d GFP positive distribution.E，Negative control group.Figure 2 Observation of GFP signal in frozen sections of liver tissue of SD rats in different groups

2.3 各組肝中人肝細胞相關蛋白的檢測情況

取各組大鼠肝組織制作石蠟切片，抗原修復，應用免疫組化法，觀察人ALB、HNF4α和HNF3β蛋白表達情況顯示相關蛋白表達隨機分布，血管周圍有相對分布較多的趨勢。如圖∶實驗組大鼠肝組織可檢測到人ALB(見圖3)、HNF4α(見圖4)和HNF3β(見圖5)蛋白的表達，對照組大鼠肝組織未檢測到這些蛋白的表達(見圖3、4、5D)。出生45 d大鼠肝內ALB、HNF4α和HNF3β蛋白的表達量總體較多，出生75 d的表達量總體較少，出生120 d的表達極少、甚至檢測不到ALB、HNF4α和HNF3β蛋白的表達。同預期結果，對照組大鼠肝組織未檢測到這些人源蛋白的表達。如圖中箭頭所示，棕黃色或褐色為相關蛋白陽性表達。

3 討論

嵌合現象在自然界廣泛存在，而在早期胚胎中更為普遍。接受骨髓移植的患者體內存在供受體來源細胞相互移居長期共存的嵌合現象[5-6]。胚胎期注射有助于嵌合體的形成和植入細胞的分化，國內外科學家應用胚胎注射法成功建立了人-綿羊造血干細胞嵌合體模型[7]和人-山羊肝嵌合體模型[8]。建立大型動物嵌合體模型的操作復雜，設備要求較高，如何在生理條件下建立可靠易行的技術方法和動物模型勢在必行。本研究首次探索運用大鼠胚胎發育期免疫系統不成熟的自然條件，研究建立人-鼠嵌合體肝的可行性。

UCMSC在分化潛能[9-10]、免疫原性、來源、倫理問題等方面都有獨特的優勢，已成為再生醫學研究領域重要的種子細胞。選擇hUCMSCs構建模型，有利于hUCMSCs在治療人類疾病中的應用，從而為轉化醫學提供更多理論支持。攜帶綠色熒光蛋白(GFP)慢病毒載體液標記細胞的方法追蹤細胞[3，11]在動物體內的分布簡便易行，GFP標記高效、無毒副作用，時間較長，便于觀察，是一種良好的干細胞標記技術。組織制作冰凍切片，在熒光顯微鏡下直接觀察綠色熒光信號的分布從而檢測植入已標記細胞的分布。本實驗用攜帶GFP的慢病毒載體液轉染標記hUCMSCs(即GFP-hUCMSCs)，便于追蹤人源細胞在肝內的分布。

注:A:45 d大鼠肝內人ALB較多廣泛表達；B:75 d大鼠肝內ALB零星較少表達；C:120 d大鼠肝內人ALB微弱表達；D:陰性對照。紅色箭頭顯示ALB表達。圖3 不同組SD大鼠肝組織中人ALB蛋白免疫組織化學染色分析Note.A，45 d of intrahepatic human ALB is more widely expressed.B，75 d of intrahepatic ALB sporadic expression is less.C，120 d of intrahepatic ALB is weak Expression.D，Negative control.Red arrows show ALB expression.Figure 3 Immunohistochemical staining analysis of human ALB protein in liver tissues of SD rats of different groups

注:A:45 d大鼠肝內人HNF3β的分布較多；B:大多75 d大鼠肝內人HNF3β表達量較低；C:多數120 d大鼠肝內檢測不到人HNF3β表達；D:陰性對照。紅色箭頭顯示HNF3β表達。圖5 不同組SD大鼠肝組織中人HNF3β蛋白免疫組織化學染色分析Note.A，The distribution of HNF3βin the liver of rats was more than 45 d.B，the expression of HNF3βin the liver of rats was lower in most of the 75 d.C，the liver of most 120 d human HNF3βexpression was not detected.D，Negative control.Red arrows show HNF3βexpression.Figure 5 Immunohistochemical staining analysis of human HNF3βprotein in liver tissues of SD rats of different groups

干細胞在動物模型體內存活和分化是模型成功與否的關鍵。冰凍切片發現實驗組大鼠肝組織中45 d綠色熒光信號較多，75 d的明顯減少，120 d時只可觀察到極少量熒光信號的存在；對照組肝組織中未檢測到綠色熒光信號。從而證明胚胎期注射的GFP-hUCMSCs可遷移到肝組織。肝富集轉錄因子(liver-enriched transcription factors)主要存在于肝并調控肝特異性基因的表達，在調控器官發育時發揮關鍵作用，促進肝代謝[12]，其中HNF3β調控HNF4α等轉錄因子在內的許多基因的轉錄，而HNF4α屬二聚體轉錄因子，是一種鋅指結構蛋白，可控制多達60%的肝基因[13]，是肝特異性基因表達的主要調節因子。且HNF4α過表達的肝祖細胞可作為細胞移植的最佳候選者[14]。HNF4α在成熟肝細胞中的表達量最高，對肝細胞分化的調控、肝的形成和肝細胞生物學功能的維護都起重要作用，諸如肝癌等[14]許多肝疾病與HNF4α表達量的異常有關。白蛋白(ALB)主要存在于血漿中，大多在肝內合成并分泌，常作為鑒定肝細胞功能正常與否的經典指標。采用免疫組化染色分析法，在出生45、75 d的實驗組大鼠肝中可檢測到人HNF3β、HNF4α和ALB蛋白的表達，出生120 d的大鼠只能檢測到人源相關蛋白的微弱表達甚至完全檢測不到。從而證明植入細胞在大鼠肝體內得到進一步分化的機會。

綜上所述可知胚胎期注射GFP-hUCMSCs能夠遷移到胎鼠肝，在胎鼠出生后的肝內存活并在至少45 d時間內得到進一步生長發育的機會，同時形成兩種來源細胞相互共存的嵌合狀態。但隨著大鼠出生時間的延長，人源細胞數量明顯減少，從側面說明人源細胞在兩種細胞生存競爭中很快處于不利地位，這可能與大鼠免疫系統的發育和植入細胞的分化有關，但其具體的調控機制有待于進一步深入研究。