雷帕霉素對大鼠腎缺血再灌注后心肌損傷的作用及機制研究

鄧 宇，李麗娜，王鵬帆，張營帥，曹福源，張 偉

(1.華北理工大學臨床醫學院，河北 唐山 063210；2.華北理工大學公共衛生學院，河北 唐山 063210；3.華北理工大學實驗動物中心，河北 唐山 063210；4.華北理工大學基礎醫學院，河北省慢性疾病重點實驗室，河北 唐山 063210)

在腎移植和腎腫瘤切除術等一些復雜的腎手術中，需要暫時阻斷腎血流。術后再灌注過程會加重缺血性腎組織損傷，該過程稱為腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion，RIR)[1]。RIR除了對腎本身造成損傷外，還可以對心、肺、腦等遠隔器官造成損害[2]。RIR過程中所產生的毒性代謝產物和炎性介質，易進入血液循環，從而影響作為遠隔器官心臟的代謝與功能。心臟血流量大，易受循環中有害物質影響而出現結構和功能損傷，其中免疫損傷在腎缺血再灌注后的心肌損傷中起重要作用。研究表明，免疫系統干預可能對RIR后心臟有保護作用。雷帕霉素是一種免疫抑制劑(RAPA)，可以通過受體FK50結合蛋白12結合靶標(mTOR)[3]，以抑制其信號傳導，從而減少G1期晚期免疫細胞的停滯并抑制免疫反應。RAPA對RIR后心臟的保護機制仍不清楚。盡管國內外諸多學者在雷帕霉素對腎臟缺血再灌注損傷方面做了大量的研究工作，但RAPA對RIR后心臟的保護機制仍不清楚。因此，我們對RAPA對RIR后心臟的保護作用進行了探討，以期從免疫反應角度尋找減輕RIR后心臟損傷的方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD健康雄性大鼠40只，體重20～25 g(誤差不大于10%)，周齡:8～9周，購自北京維通利華實驗動物中心技術有限公司[SCXK(京)2017-0001]，在唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室[SYXK(冀)2015-0038]完成實驗。動物實驗經華北理工大學實驗動物倫理委員會審核批準(2017080)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

全自動生化分析儀及流式細胞儀均購自美國加利福尼亞州Beckman Coulter公司；生化檢測試劑盒由南京建成生物制品公司提供，實驗方法參見試劑盒說明；高倍率顯微鏡購自日本東京奧林巴斯公司；TUNEL試劑盒購自武漢博斯特生物科技有限公司；二抗購自北京中山生物技術公司；RT-qPCR所用試劑盒購自中國大連TaKaRa生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物的處理

大鼠分為4組:(1)空白組:10只，常規飼養3 d。(2)假手術組:10只，常規飼養3 d。(3)RIR組:10只，常規飼養3 d。(4)雷帕霉素處理組:10只，每日灌胃給予雷帕霉素(4.5 mg/(kg/d))，持續3 d。

1.3.2 動物模型復制

大鼠稱重后用3%戊巴比妥鈉溶液(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，然后開腹，找出左右兩側腎動、靜脈后夾閉，45 min后恢復血流供應，復制大鼠腎缺血再灌注模型。操作中腎由紅變白再由白變紅，認為經歷了缺血再灌注過程，術后逐層縫合。假手術組除不夾閉雙側腎動、靜脈外，其余操作同RIR組。雷帕霉素處理組經灌胃給藥飼養3 d后再經歷手術，雷帕霉素處理組的劑量為每天4.5 mg/kg，其余操作處理同RIR組。

1.3.3 樣品采集與檢測

腹主動脈取血并留取心臟和脾組織標本。取心尖組織經HE染色，鏡檢，觀察心肌細胞的形態學變化。

1.3.4 指標測定及試劑來源

(1)血漿生化指標測定

采集腹主動脈血3 mL，加肝素，離心，采用全自動生化分析儀進行測定，連續監測1～3 min觀察吸光度的變化，計算肌酸激酶和肌酸激酶同工酶的活力值，結果以103U/L表示。

(2)腎功能

腎灌注后24 h，經腹主動脈取血分成兩部分，一部分血液檢測尿素氮，另一部分檢測肌酐。肌氨酸氧化酶法測定肌酐，脲酶法測定尿素氮。

(3)心臟病理損傷的半定量分析

剖開胸腔，取出心臟，洗凈，甲醛固定，脫水浸蠟，石蠟包埋，PAS染色，觀察病理切片并進行心臟病理損傷的半定量分析。在高倍率顯微鏡(200×)隨機地選擇10個視野，觀察損傷程度。運用半定量病理評估法評分，標準為:正常為0，損傷＜25% 1分，損傷25%～50% 2分，損傷51%～75% 3分，損傷＞75% 4分。

(4)細胞凋亡測試

心臟經固定過夜，石蠟包埋，依據熒光及顯色法，在DNA斷裂時3’-OH暴露被抗熒光素抗體標記，經過PBS漂洗，水沖洗，用濾紙吸干水分，加樣，在DAB的催化下室溫孵育5～30 min呈棕色，觀察凋亡細胞狀況并在顯微鏡下拍照保存。根據TUNEL試劑盒指示說明操作。顯微鏡下的紅色熒光為TUNEL陽性細胞。隨機選擇六個非重復視野(200×)，凋亡指數(AI):AI(凋亡計數/總細胞計數)×100%。

(5)流式細胞儀

將大鼠的血液，脾和心臟制成單細胞懸液，在免疫染色之前裂解紅細胞，用無菌PBS和BSA緩沖液洗滌，加入一抗的重懸細胞，避光保存，PBS離心洗滌，加入二抗，洗滌，進入Cellquest調整優化細胞流速和濃度，使目標細胞通過進樣室的速度為2000/s左右，進行細胞分選，用流式方法檢測分析NKT細胞。NKT細胞判定標準為CD3和NK1.1雙陽性。心臟總RNA用TRIzol提取。純化后，將RNA樣品用于反轉錄以合成cDNA。

(6)RT-qPCR檢測VEGF，HIF-1α和CXCL10 mRNA水平。

PCR反應中使用的引物為:β-肌動蛋白正向，5’-AGGCATCCTGACCCTGAAGTA-3’和反向，5’-GA GGCATACAGGGACAACACACAG-3’；CXCL10正向5’-ACTGCATCCATATCGATGAC-3’和反向5’-TTC ATCCTGCAATGATCTC-3’；HIF-1α正向，5’-AAG TCTAGGGATGCAGCAC-3’，反向，5’-CAAGATCACC AGCATCTAG-3’；VEGF正向為5’-ATTGAGACCC TGGTGGACATC-3’，反向為5’-TCCTTTCCTCGA ACTGATT-3’。使用2-ΔΔCq方法將每個基因的表達水平標準化為內源性對照β-肌動蛋白。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行分析，各組數據以平均數±標準差(±s)的形式表示，單因素方差分析q檢驗統計處理各組之間的差異，以P＜0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠生存情況

在實驗過程中，由于損傷缺口小，研究人員能夠迅速找到腎動靜脈，進行分離夾閉。夾閉時間45 min較短，因此在恢復再灌注過程中大鼠一直是存活的。動物在麻醉的狀態下進行取材，先抽取腹主動脈血液，迅速摘取脾和心臟。

2.2 血漿CK、CK-MB、BUN和Scr水平

與RIR組相比，雷帕霉素處理組血漿中CK、CK-MB水平降低(P＜0.01)。與假手術組相比，RIR組CK、CK-MB水平升高(P＜0.01)。血漿BUN和Scr水平經過再灌注后升高，尤以RIR組與假手術組相比升高的更明顯(P＜0.01)，見表1。

2.3 HIF-1α，VEGF和CXCL10 mRNA的表達水平

RIR組HIF-1α和VEGF mRNA的表達水平高于假手術組(P＜0.05)，雷帕霉素處理組HIF-1α和VEGF mRNA的表達水平低于RIR組(P＜0.05)。RIR組中CXCL10 mRNA的表達水平低于假手術組(P＜0.05)，雷帕霉素處理組高于RIR組(P＜0.05)，見表2。

2.4 NKT細胞百分比

RIR組脾中NKT細胞的百分比低于假手術組(P＜0.05)，雷帕霉素處理組脾中NKT細胞的百分比顯著低于RIR組(P＜0.01)。心臟和外周血中NKT細胞的百分比RIR組高于假手術組(P＜0.05)，并且雷帕霉素處理組顯著高于RIR組(P＜0.01)，見圖1。

2.5 心肌組織形態學變化

空白組和假手術組大鼠的心肌細胞大小、形態均正常。RIR組:心肌纖維紊亂，間質腫脹，炎性細胞浸潤。雷帕霉素處理組:心肌纖維排列尚整齊，間質腫脹和炎性細胞浸潤程度較RIR組有所減輕，見圖2。

3 討論

腎缺血再灌注損傷是腎血液不足，恢復血液循環灌注后其功能損傷反而加重，組織結構無法恢復正常的一種病理生理狀態。炎性細胞因子和氧自由基除對腎本身造成損傷外[4-6]，還對心臟、肺、肝等遠隔器官造成損傷，尤其是需氧、需血量極大的心臟。在腎缺血再灌注到心肌損害過程，免疫反應是重要反應之一。缺血再灌注損傷作為一個非免疫性因素能通過免疫機制影響心臟的損傷程度[7]。

雷帕霉素是一種新型免疫抑制劑，可通過受體FK50結合蛋白-12與靶蛋白(mTOR)結合，抑制其信號轉導，從而減少晚期G1期免疫細胞的停滯，抑制免疫應答。免疫抑制劑可以通過抑制炎癥反應從而減輕缺血再灌注后對組織器官的損害[8]。據報道雷帕霉素經過非直接通路方式使激活的T細胞凋亡，通過阻礙抗原呈遞過，抑制DC細胞成熟，使細胞因子的分泌減少，阻止DC在心肌組織遷移集聚，可以明顯改善大鼠RIR后心臟的結構和生理功能[9]。

表1 各組血漿中CK，CK-MB，BUN和Scr含量變化(±s，n＝10)Table 1 Values of CK，CK-MB，BUN and Scr in different groups

表1 各組血漿中CK，CK-MB，BUN和Scr含量變化(±s，n＝10)Table 1 Values of CK，CK-MB，BUN and Scr in different groups

注:與假手術組比，△△P＜0.01；與RIR組比，*P＜0.05，**P＜0.01。Note.Compared with the Sham group，△△P＜0.01.Compared with the RIR group，*P＜0.05，**P＜0.01.

分組Groups CK 103 U/L CK-MB 103 U/L BUN mg/dL Scr mg/dL空白組Control group 0.49±0.04 0.75±0.07 157.80±10.62 7.90±0.60假手術組Sham group 0.61±0.05 0.88±0.13 163.60±12.26 8.10±0.70 RIR組RIR group 11.05±1.46△△ 14.31±2.09△△ 701.40±60.45△△ 21.50±2.10△△RAPA+RIR組RAPA+RIR group 9.32±1.33** 11.22±1.95** 340.30±31.02* 14.20±1.30*

表2 CXCL10、HIF-1α和VEGF mRNA在不同組中的表達水平(±s，n＝10)Table 2 Expression levels of CXCL10，HIF-1αand VEGF mRNA in the different groups

表2 CXCL10、HIF-1α和VEGF mRNA在不同組中的表達水平(±s，n＝10)Table 2 Expression levels of CXCL10，HIF-1αand VEGF mRNA in the different groups

注:與假手術組對比，△P＜0.05；與RIR組對比，*P＜0.05。Note.Compared with the Sham group，△P＜0.05.Compared with the RIR group，*P＜0.05.

組別Groups HIF-1α VEGF CXCL10空白組Control group 0.0115±0.005 0.0159±0.0013 0.4839±0.041 RIR組RIR group 0.0167±0.008△ 0.0201±0.0016△ 0.2753±0.028△RAPA+RIR組RAPA+RIR group 0.0139±0.007* 0.0187±0.0015* 0.3349±0.037*

注:與假手術組相比，△P＜0.05；與RIR組相比，**P＜0.01。圖1 各組小鼠脾、心臟及外周血中NKT細胞百分比Note.Compared with the Sham group，△P＜0.05.Compared with the RIR group，**P＜0.01.Figure 1 Percentage of NKT cells in spleen，heart and peripheral blood of mice in each group

注:a:空白組；b:假手術組；c:RIR組；d:RAPA+RIR組。圖2 四組心肌細胞形態學研究Note.a，Control group.b，Sham group.c，RIR group.d，RAPA+RIR group.Figure 2 Myocardia morphology among four groups

心臟運轉過程需氧量大，容易被RIR過程中產生的有害物質所損傷。心肌受損傷時會促進CK、CK-MB等因子釋放，其釋放量入血越多，心肌病變程度越高。因此，血清心肌酶活性的測定可用來體現心肌細胞損傷程度[10]。氧化應激使細胞膜通透性增強，CK、CK-MB滲出增加，其在血清中的含量大幅度提高[11]。在本研究中，與假手術組比較，RIR組損傷水平顯著加劇。與RIR組相比，雷帕霉素處理組損傷程度減輕。該結果與Feng等[12]人在2018年內的研究結果相符，表明雷帕霉素能夠減少氧化應激對心肌的損傷、降低心肌細胞膜的通透性，從而起到對RIR致心肌損傷的保護作用。

腎缺血再灌注損傷產生的炎癥因子以及低氧誘導因子可導致心肌細胞凋亡。因此推斷心肌細胞凋亡可能是導致心肌損傷的原因之一。RIR時心肌細胞凋亡數量顯著增高。相較RIR組，雷帕霉素處理組細胞凋亡數量顯著減少。該結果顯示RIR后心肌組織受損明顯，而處理雷帕霉素對RIR后的心肌損傷起保護作用[13]。

趨化因子CXC亞家族，如CXCL10，其特殊作用于NK細胞表面受體?？哨吇瘑魏思毎?、T淋巴細胞、和自然殺傷(NK)細胞等進入炎癥部位，介導缺血后再灌注產生的遠隔器官損害[14]。RIR迅速激活機體的免疫系統[15]。在趨化因子的作用下，心肌中集聚的CD4+T細胞逐漸增多。這些趨化因子可能通過正反饋促進自身的分泌，形成有效的濃度梯度，誘導CD4+T細胞的浸潤，從而放大這一免疫反應過程。使得心肌組織受損程度增加。結果表明，相比于RIR組，假手術組心肌組織中的CXCL10含量顯著增加，雷帕霉素處理組含量升高且差異具有統計學意義，該結果與Zhang等[3]人在2018年的研究結果一致。這說明正常機體CXCL10也有表達，RIR時，機體消耗大量趨化因子來介導CD4+T細胞的活化，導致自身含量的減少。雷帕霉素處理組其含量有所增加，表明機體的免疫反應受到了雷帕霉素的抑制，使得對心肌細胞有損害的CD4+T細胞數量的減少，所需要的趨化因子數量也減少，因此，CXCL10的數量有所上升。這說明在RIR后心肌損傷加重，而雷帕霉素可緩解大鼠心肌受損，發揮對心肌顯著的保護作用。

NKT細胞包括CD3和NK1.1雙陽性細胞，它是一種免疫細胞，其在TCR受到刺激后1～2 h內被激活，迅速產生多種類型的細胞因子[16-18]。研究表明，NKT細胞在缺血后再灌注導致的損傷過程中扮演重要角色。其中NKT細胞可以通過外周血從脾中募集到靶器官。為保護機體，免疫系統中的NKT細胞可以通過分泌Th2型細胞因子IL-10發揮抑制免疫細胞的作用，降低T細胞在RIR時對心肌細胞的損害作用。由實驗結果可知，脾中NKT細胞百分比呈逐漸下降趨勢，心臟和外周血NKT細胞百分比呈逐漸上升趨勢，差異具有統計學意義，結果與Pan等[19]人在2019年的研究結果一致。這說明，機體在受到炎癥反應時，可本能地刺激機體產生免疫反應進行自我保護。RIR對機體造成損害，激發了機體自身的保護機制。RIR后心肌組織損害程度加重，在給予雷帕霉素后，心肌損傷有所好轉?？赡軝C制是雷帕霉素上調CXCL表達水平，促進NKT細胞聚集增多，使得外周血和心臟組織NKT細胞的正反饋集聚增加，因此使再灌注后的心肌受損減輕[11]。

缺氧誘導因子-1(HIF-1)，是一種調控靶基因、缺氧適應和炎癥的轉錄活性核蛋白。它主要由在細胞中參與生長發育調節的兩個亞基構成，HIF-1α主要參與缺氧反應應答；而HIF-1β的功能是穩定細胞內的基因轉錄表達。HIF-1a對氧濃度敏感，在RIR的條件下，由于機體缺血缺氧，HIF-1α的降解途徑阻斷(VHL蛋白能識別并與其形成復合物，阻止HIF-1α的降解作用)，導致HIF-1α的mRNA含量上調。HIF-1α在中間區域與HIF-1β發生結合，產生異二聚體，正反饋調節VEGF mRNA表達，改善血管通透性[20]。本實驗研究顯示，VEGF和HIF-1α的表達水平在RIR組和雷帕霉素處理組高于假手術組(P＜0.05)，雷帕霉素處理組和RIR組相比VEGF和HIF-1αmRNA水平明顯降低(P＜0.05)。該結果與伊利亞爾等[21]的研究結果一致。說明在RIR后心臟受到損傷，機體啟動免疫反應，激活血管新生信號通路，上調HIF-1α的表達，這一過程導致血管內皮細胞增殖，促進心肌供血供氧以對抗RIR后心肌損傷[20-22]。而雷帕霉素給藥干預后，其藥物可以使乳酸含量增高，促進無氧代謝活動，短時間弱化心肌需氧量，導致HIF-1αmRNA表達下調。

VEGF mRNA可誘導內皮細胞活性氧自由基生成，在氧化應激中促進細胞凋亡，引起炎癥發生[23-24]。白細胞和內皮細胞在炎癥因子作用下粘附聚集而發生炎癥反應，從而導致微循環障礙。本實驗研究顯示，相比于假手術組，RIR組的心肌細胞中VEGF mRNA水平顯著上調，結果具有統計學意義；與RIR組相比，雷帕霉素處理組VEGF mRNA水平下調，結果具有統計學意義，該結果與Zhang等[3]人在2018年的研究結果一致。雷帕霉素給藥后，能夠通過抑制mTOR通路，進而抑制HIF-1α表達，最終導致VEGF表達量下降[25]。雷帕霉素對心肌的保護作用，可能與減少VEGFmRNA的表達，從而減少活性氧自由基的生成有關。

綜上所述，雷帕霉素可減輕RIR大鼠心肌損傷。作用機制可能與增加NKT細胞數量，抑制HIF-1α和VEGF的表達，上調CXCL10的表達，從而增強RIR后心臟的抗炎、抗凋亡作用有關。