熊果酸通過抑制自噬對血清剝奪誘導的H9c2細胞起抗凋亡作用

何明靜，黃世杰，孫祥琳，韋 俊，周 茜，陳力嘉

(1.攀枝花學院醫學院解剖教研室，四川 攀枝花 617000；2.攀枝花學院康養學院，四川 攀枝花 617000)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic cardiopathy)簡稱冠心病，其常見癥狀是心肌缺血(myocardial ischemia)，極易造成死亡，威脅人類生命安全[1]。嚴重的缺血會誘導細胞死亡機制的激活，如壞死、細胞凋亡和自噬[2]。自噬和細胞凋亡在調節心血管疾病中起重要作用[3]。自噬與細胞凋亡的關系十分復雜，自噬的激活既可以抑制也可以促進細胞凋亡[4-5]。熊果酸是一種五環三萜類化合物，已有大量文獻報道其有抗腫瘤[6-8]、降血糖血脂[9]、抗菌[10]以及抗氧化[11-12]的功效。已有報道稱，熊果酸對缺血再灌注損傷的H9c2細胞具有保護作用[13]。在癌癥領域中，國內外均有研究表明熊果酸促進癌細胞的自噬以達到抗癌作用[14-17]。然而，熊果酸對心肌缺血后自噬的作用未見報道，故本研究采用血清剝奪的方法模擬心肌缺血，構建心肌缺血體外模型，以自噬的角度探討熊果酸對心肌細胞的保護機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

大鼠H9c2心肌細胞購自普諾賽生命科技有限公司(武漢，中國)。

1.2 主要試劑

DMEM/F12培養基、胎牛血清購自HyClone公司(美國)；青鏈霉素雙抗、PBS緩沖液購自Gibco公司(美國)；熊果酸(U6753)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)(M9281)、雷帕霉素(R0395)購自Sigma-Aldrich公司(美國)；Annexin V-APC/PI凋亡檢測試劑盒(ECK-A217)購自伊萊瑞特生物科技股份有限公司(武漢，中國)；ECL試劑盒購自索萊寶科技有限公司(北京，中國)；RIPA裂解液購自碧云天生物技術有限公司(上海，中國)；蛋白質定量(Bicinchoninic Acid，BCA)試劑盒購自Thermo Fisher公司(美國)；LC3兔多克隆抗體(ab48394)、Beclin1兔多克隆抗體(ab62557)、ATG5兔單克隆抗體(ab108327)、BcL-2兔多克隆抗體(ab59348)、Bax兔單克隆抗體(ab32503)、cleaved-caspase3兔多克隆抗體(ab49822)、β-actin兔多克隆抗體(ab5694)以及山羊抗兔IgG H＆L(HRP)二抗(ab205718)均購自Abcam公司(英國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養及分組

大鼠H9c2心肌細胞用DMEM/F12培養基進行培養，并補充10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL的鏈霉素，培養箱條件為37℃，5% CO2。每2 d換液1次，當細胞生長至80%融合時傳代。分組情況如下:(a)對照組:繼續采用含10%胎牛血清、雙抗的培養基培養。(b)剝奪血清組:根據參考文獻[18]，用無血清的DMEM/F12培養基培養24 h。(c)熊果酸組:為了確定熊果酸的適合濃度，在含10%胎牛血清、雙抗的培養基的條件下，使用0、5、10、20、40μmol/L熊果酸預處理細胞，篩選出合適濃度后，再用含合適濃度熊果酸的無血清DMEM/F12培養基培養24 h。(d)熊果酸+3-MA處理組:根據參考文獻[19]使用10μmol/L 3-MA預處理細胞2 h，再用含合適濃度熊果酸的無血清DMEM/F12培養基處理細胞24 h。(e)熊果酸和雷帕霉素處理組:根據參考文獻[20]，使用100μmol/L雷帕霉素預處理細胞2 h，再用含合適濃度熊果酸的無血清DMEM/F12培養基處理細胞24 h。

1.3.2 蛋白免疫印跡分析

用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞，用裂解液裂解30 min，在4℃以11 000 r/min離心10 min。隨后，參照說明書使用BCA測定法測量蛋白質濃度。通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質樣品。隨后將蛋白質轉移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂乳封閉膜1 h，并用LC3、Belin、ATG5、BcL-2、Bax、cleaved-caspase3、β-actin一抗孵育，4℃過夜，再用山羊抗兔IgG H＆L(HRP)二抗在室溫下孵育1 h，洗膜后經ECL試劑盒顯影，使條帶可視化，再使用Image-ProPlus 6.0軟件對條帶進行定量分析。

1.3.3 Annexin V-APC/PI雙染法流式細胞術檢測細胞凋亡

H9c2細胞經PBS洗滌后，用胰酶消化并離心，PBS重懸細胞，取1×105細胞重懸細胞，離心后棄上清，再用PBS洗滌細胞1次，離心棄上清后加入500 μL的1×Annexin V Binding Buffer重懸細胞。隨后分別加入5μL Annexin V-APC和5μL PI，4℃避光孵育15 min。反應完成后，用1 mL PBS洗滌1次，使用FACSCaliburTM流式細胞儀(BD Biosciences，美國)檢測細胞凋亡。

1.4 統計學方法

應用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計數資料以平均數±標準差(±s)表示，統計采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度熊果酸處理對H9c2細胞的影響

實驗采用0、5、10、20、40μmol/L熊果酸處理正常培養的H9c2細胞，用流式細胞術檢測細胞凋亡情況，實驗結果如圖1所示。與空白對照組相比，20、40μmol/L熊果酸處理組細胞凋亡率上升(P＜0.001)，10μmol/L處理組與空白對照組凋亡率差異不顯著，因此后續實驗采用10μmol/L熊果酸處理H9c2細胞。

2.2 熊果酸減輕血清剝奪H9c2細胞造成的自噬

為研究熊果酸是否能影響H9c2細胞血清剝奪介導的自噬，用10μmol/L熊果酸預處理H9c2細胞1 h，再在血清剝奪的情況下培養24 h，然后檢測自噬相關蛋白的表達，結果如圖2。與對照組相比，血清剝奪自噬相關蛋白ATG5、Beclin1表達量極顯著上升(P＜0.001)，LC3II/I的比值顯著上升(P＜0.01)。而熊果酸處理組有效的降低了ATG5、Beclin1的表達(P＜0.001)以 及LC3II/I的 比值(P＜0.05)。

2.3 熊果酸通過抑制自噬減輕了血清剝奪誘導的H9c2細胞凋亡

注:與0μmol/L組相比，***P＜0.001。圖1 不同濃度熊果酸對H9c2細胞凋亡率的影響Note.Compared with 0μmol/L group，***P＜0.001.Figure 1 Effects of different concentrations of ursolic acid on the apoptosis rate of H9c2 cells

為了探討H9c2細胞血清剝奪后自噬與凋亡的關系，運用流式細胞術檢測熊果酸處理血清剝奪的H9c2細胞的凋亡情況，并分別運用自噬的抑制劑3-MA和自噬的激活劑雷帕霉素聯合熊果酸處理血清剝奪的H9c2細胞，觀察細胞凋亡的變化，結果如圖3所示。與對照組相比，血清剝奪組凋亡率極顯著上升(P＜0.001)，熊果酸處理組降低了凋亡率(P＜0.01)，熊果酸聯合3-MA組進一步降低了凋亡率(P＜0.001)，而雷帕霉素的處理消除了熊果酸的抗凋亡作用。

注:A:ATG5、Beclin1、LC3I、LC3II的蛋白免疫印跡圖；B:ATG5的相對表達量；C:Beclin1的相對表達量；D:LC3 II/I的比值，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05，下同。圖2 熊果酸處理后，H9c2細胞ATG5、Beclin1表達水平以及LC3II/I比值變化Note.A，Western blot assay of ATG5，Beclin1，LC3I，LC3II andβ-actin.B，Relative expression of ATG5.C，Relative expression of ATG5.D，Ratio of LC3II/I，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05，the same as bellow.Figure 2 Changes of ATG5，Beclin1 expression levels and LC3II/I ratio in H9c2 cells after ursolic acid treatment

圖3 熊果酸對H9c2細胞血清剝奪后的抗凋亡作用以及自噬被抑制或增強后熊果酸抗凋亡作用的變化Figure 3 Anti-apoptotic effect of ursolic acid on serum deprivation of H9c2 cells，and changes of the anti-apoptotic effect of ursolic acid after autophagy is inhibited or enhanced

2.4 熊果酸通過增加BcL-2的表達，降低Bax、cleaved-caspase3的表達起抗凋亡作用

為了進一步探討熊果酸抑制自噬后的抗凋亡機制，運用蛋白免疫印跡試驗(Western blot)檢測凋亡相關蛋白BcL-2、Bax、cleaved-caspase3的表達，結果如圖4所示。與對照組相比，剝奪血清組BcL-2表達量極顯著下降(P＜0.001)，cleaved-caspase3、Bax表達量以及Bax/BcL-2比值顯著上升(P＜0.001)；熊果酸處理使BcL-2表達量回升(P＜0.01)，cleaved-caspase3、Bax表達量以及Bax/BcL-2比值下降(P＜0.01)；熊果酸聯合3-MA進一步使BcL-2表達量回升(P＜0.001)，使cleaved-caspase3表達量以及Bax/BcL-2比值下降(P＜0.001)；雷帕霉素干預后Bax/BcL-2的比值回升(P＜0.05)(圖4C～4F)。

3 討論

伴隨著我國經濟發展和人們生活方式的改變以及老齡化人口的增加，冠心病發病率呈上升趨勢[21]。冠心病容易引起心肌缺血，造成心肌能量代謝紊亂，可能造成心絞痛、心肌梗死、缺血性心肌病甚至猝死，嚴重威脅人類生命健康[22]。早期研究發現，心肌缺血會導致自噬[23]。本研究采用血清剝奪來模擬體外心肌缺血，該方法已被報道用于心肌缺血的機制研究[18，24-25]。在本研究中，再次證實了剝奪血清來模擬心肌缺血會造成H9c2細胞自噬程度增加。

越來越多的報道表明，干預自噬可以保護心肌缺血造成的損傷。一直以來，自噬對心肌缺血起保護作用還是損害作用存在爭議，自噬對心肌缺血的作用尚未完全闡明[26]。Kanamori等[27]運用巴弗洛霉素A1抑制自噬，發現抑制自噬后增加了動物模型心肌梗死面積，表明自噬是一種先天性和有效的過程，可以保護心肌細胞免于急性心肌梗死時的缺血性死亡。Li等[28]人發現阿托伐他汀能夠激活AMPK/mTOR途徑誘導自噬并抑制細胞凋亡，從而改善了缺血心肌面積和功能。然而，在嚴重缺血的情況下，心臟的過度自噬可能促進心肌細胞死亡并使心臟功能惡化[29]。Zhang等[30]提出，在心肌缺血或梗塞過程中，缺氧誘導的損傷通過誘導細胞凋亡和過度自噬過程成為心臟損傷的主要因素之一。Liu等[31]發現，外泌體轉運的miR-93-5p通過靶向ATG7抑制自噬和炎性因子的表達，在急性心肌梗塞的動物模型和體外模型中對心肌細胞發揮保護作用。Jia等[2]指出，黃連素(小檗堿)可以抑制過度自噬，從而使缺氧的大鼠H9c2細胞存活。Pattingre等[32]早前提出，自噬是體內平衡的必要條件，是對營養缺乏和其他形式細胞應激的適應性反應。然而，如果自噬水平被誘導超過生理范圍，自噬可能導致死亡執行。

注:A:BcL-2、Bax、cleaved-caspase3蛋白免疫印跡條帶圖；B:BcL-2相對表達量；C:Bax相對表達量；D:BcL-2/Bax比值；E:cleaved-caspase3相對表達量。圖4 熊果酸處理對H9c2細胞血清剝奪后的凋亡相關蛋白表達變化Note.A，Western blot assay of BcL-2，Bax and cleaved-caspase3.B，Relative expression of BcL-2.C，Relative expression of Bax.D，Ratio of Bax/BcL-2.E，Relative expression of cleaved-caspase3.Figure 4 Expressions of apoptosis-related proteins after serum deprivation of H9c2 cells by ursolic acid treatment

熊果酸是廣泛存在于各種天然植物中的五環三萜類化合物，已經被證明具有抗腫瘤、降血糖血脂、抗感染、抗氧化等作用[6-12]。近幾年，已有研究表明熊果酸對心肌缺血以及心肌缺血再灌注造成的損傷具有保護作用。王佳等[33]發現熊果酸能抑制氧化應激損傷和脂代謝紊亂，從而改善心肌免受心肌梗死損傷。趙瑞芳[34]則指出熊果酸同樣能改善心肌缺血再灌注造成的心肌損傷，其機制也與抑制氧化應激損傷有關。在熊果酸影響細胞自噬方面，大多集中在癌癥研究領域。盧文等[14]通過實驗表明，熊果酸通過增強自噬抑制了宮頸癌細胞的增殖。羅敏等[15]則發現熊果酸處理人肺癌PC9細胞后，自噬相關蛋白ATG5表達升高，LC3II/I比值升高，說明熊果酸增加了PC9細胞的自噬，并抑制了PC9細胞的增殖。然而，關于熊果酸在保護心肌細胞缺血損傷時，是否通過自噬產生作用還未見報道。本研究發現，加入熊果酸后，自噬相關蛋白ATG5、Beclin1表達量降低，LC3II/I比值也降低，表明自噬被抑制。接下來檢測了H9c2細胞的凋亡情況，發現加入熊果酸后，H9c2細胞凋亡率降低，再次證明熊果酸對缺血心肌細胞有保護作用，且推測熊果酸對H9c2細胞的抗凋亡作用可能與自噬被抑制有關。為了進一步驗證熊果酸對H9c2細胞的抗凋亡作用與自噬相關，本研究選用了自噬抑制劑3-MA和自噬激動劑雷帕霉素分別聯合熊果酸處理H9c2細胞，發現熊果酸聯用3-MA進一步降低細胞凋亡率，而熊果酸聯用雷帕霉素使凋亡細胞增多，推測血清剝奪會造成H9c2細胞自噬，且超出其生理水平，引發細胞凋亡，熊果酸可以抑制這種過度自噬，保護H9c2細胞。

為了進一步驗證熊果酸通過抑制自噬對H9c2細胞的抗凋亡機制，本研究檢測了BcL-2、Bax以及cleaved-caspase3的蛋白表達量。BcL-2家族是線粒體凋亡途徑的有效調節蛋白家族，該家族包括了抗凋亡蛋白BcL-2和促凋亡蛋白Bax。Bax和BcL-2的比例已被用作代表凋亡效應的標志[35]。Caspase3是介導細胞凋亡的caspase蛋白家族的成員之一，caspase3被剪切為cleaved-caspase3后激活并導致細胞凋亡[36]。本研究發現，與血清剝奪組相比，熊果酸處理和熊果酸聯用3-MA組Bax/BcL-2比值和cleaved-caspase3表達明顯降低。這表明熊果酸通過增加抗凋亡蛋白BcL-2和降低促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase3表達發揮抗凋亡作用，自噬進一步被抑制后，抗凋亡作用進一步增強。而用雷帕霉素激活自噬后，熊果酸的抗凋亡作用被削減。

Pattingre等[32]認為BcL-2能與Beclin1結合從而抑制Beclin1介導的自噬，Beclin1和BcL-2家族蛋白的相對含量決定了從細胞存活到細胞死亡的轉變。Xu等[37]發現，過表達BcL-2或敲低Beclin1表達可以限制自噬的過度激活，并在營養剝奪脅迫下防止細胞凋亡。故本研究推測熊果酸的抑制自噬和抗凋亡作用可能與改變BcL-2和Beclin1的相對含量有關。

綜上，本研究通過體外實驗探究了熊果酸在心肌缺血過程中凋亡與自噬的保護作用及其機制，并證實熊果酸對剝奪血清的心肌細胞的抗凋亡作用與抑制其過度自噬有關，后續還需要體內實驗進行驗證。