一種開源的多功能動物行為學實驗系統

鞏 臣，張炎杰，張 檬，石峙岳，劉 湘，柳 攀，廖曉玲，周 藝，劉 雪*

(1.重慶科技學院 納微復合材料與器件重慶市重點實驗室，重慶 401331；2.重慶科技學院 納微生物醫學檢測技術重慶市工程實驗室，重慶 401331；3.中國人民解放軍陸軍軍醫大學 神經生物學教研室，重慶 400038)

動物行為學實驗是生物醫學研究的重要手段之一，在腦科學研究特別是高水平研究工作中得到越來越廣泛的應用[1]。但由于動物行為學實驗是基于動物活體的行為觀察，與傳統的生理、分子、細胞等研究手段差別較大，且專用行為學平臺價格不菲，這些因素從不同程度上阻礙了動物行為學研究的推廣[2]。開源系統，是20世紀80年代提出的概念，現在被廣泛應用于軟件的開發等計算機學科中，其全稱為開放源代碼，最大的特點是開放，即任何人都可得到軟件的源代碼，可以加以修改，甚至在版權允許范圍之內重新發放——因此，開源系統特別適用于有意開展動物行為學研究但缺乏具體研究經驗的院校及課題組使用。

根據研究內容不同，動物行為學實驗有多種類型。神經科學中常見的動物行為學范式包括穿梭箱避暗實驗、水迷宮、Y迷宮、條件性位置偏好實驗等。目前市面上大部分實驗系統，運用一種訓練裝置只能進行一種實驗項目[3-5]，且受到設計專利和軟件著作權的影響，在源代碼未知的情況下，使得購買的裝置無法自主調整或擴展進行同類實驗研究，無法滿足日益增長的個性化實驗需求，因此迫切需要一種開源的實驗系統來滿足靈活的訓練需求。

穿梭箱作為行為學實驗基礎設備應用廣泛，具有潛在的多樣化實驗需求，因而我們基于開源共享協議，以傳統穿梭箱裝置為基礎[6-7]設計研發了一套多功能大鼠穿梭箱訓練系統，在進一步加強穿梭箱訓練裝置的靈活性和協同性的同時，降低動物學習行為研究的門檻并提高實驗效率，深入研究大鼠學習記憶功能。該裝置具有高度靈活性，實驗者可根據自己的需求更改配置，實現多種條件刺激聯合訓練的功能。

本實驗系統完全開源，其下載地址為:https://github.com/Barzarrhey/Labview。實驗者可以自行更改程序代碼，適配于不同種動物行為探究實驗，如切斷電刺激，設定人工照明，即可作為曠場實驗研究裝置；將箱體兩側用隔板隔開，即可作場景恐懼研究實驗裝置；更改箱體材料透明度，可用作明暗箱實驗。構建開源平臺可以讓用戶根據自身需求修改設置，具有更廣闊的使用空間。程序開源使得實驗者更好的掌握程序運行原理，可以更好的選擇與之相配套的裝置進行升級改裝工作。在數據處理、實驗步驟等方面逐漸建立一套標準化實驗模型，有利于他人在使用時能快速熟悉實驗。本實驗系統可以訓練大鼠在復雜環境下認知學習，訓練環境更貼近現實，使得實驗數據的分析更加簡便、客觀、真實，有利于神經科學的研究[8-9]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級8周齡SD雄性大鼠38只，體重240～260 g，購自陸軍軍醫大學動物中心[SCXK(渝)2017-0002]，于陸軍軍醫大學動物房飼養并取材[SYXK(渝)2017-0002]，相對濕度70%，環境溫度(24±2)℃，光照12 h/12 h明暗交替，并按照3R原則(replacement，reduction，refinement)給以人道關懷。動物適應性喂養3 d后，隨機為傳統單音頻訓練組混合音頻訓練組每組分配4只實驗動物，為傳統訓練組和穿梭箱混合訓練組每組分配5只實驗動物。為正常動物與習得場景恐懼模型動物對比實驗組分配10只動物。

1.2 實驗系統組成

本實驗由穿梭箱體、控制電路、檢測電路、刺激電路、單片機、上位機和開源系統組成。

1.2.1 實驗裝置主體

實驗裝置主體按照傳統穿梭箱體設計，箱體材質為黑色啞光亞克力有機玻璃，規格為140 cm×60 cm×70 cm，分為箱體和蓋板兩部分，蓋板中間安置有紅外高清攝像頭。箱體內部中間位置設垂直隔板，將箱體分為A、B兩室，隔板中間有通道使得兩室相通。兩室下方為間隔0.5 cm的不銹鋼材質的鋼柵。在施加非條件刺激時，外接直流電源連通，電擊實驗動物足底，引起痛覺從而達到刺激的效果。鋼柵底部有可活動的抽屜，用于承接動物排泄物，便于清理。兩室頂部有燈泡(光刺激)和揚聲器(聲刺激)，用來產生條件刺激。結構圖見圖1。

1.2.2 檢測電路

箱體頂部安裝有紅外高清攝像頭，通過USB接口與上位機連接，配合計算機圖像識別算法，可以實時檢測動物所在位置，供計算機處理分析。

1.2.3 刺激電路

刺激電路由單片機、繼電器、上位機組成。在僅使用單個箱體實驗時，采用雙路繼電器，兩個常閉口分別接箱體底部偶數鋼柵，奇數鋼柵接地。為提高實驗效率，同時對多只實驗動物進行訓練，本實驗系統亦最多兼容四路穿梭箱同時運行，此時可采用八路繼電器。在需要產生非條件刺激時，上位機通過USB串口與單片機通訊，單片機產生TTL電平信號控制繼電器的開合。繼電器接有直流恒流電源，電流強度可調(建議0.5～1 mA)，見圖2所示。

1.2.4 軟件設計

本實驗依托Labview軟件設計了實驗平臺，系統程序界面截圖如圖3所示。

圖1 實驗裝置結構示意圖Figure 1 Schematic diagram of experimental device

圖2 刺激電路圖Figure 2 Stimulation circuit diagram

圖3 軟件界面Figure 3 The software interface

軟件系統設計采用框架結構，軟件界面下可對各項參數進行設置，每項參數都有默認值，可根據實驗需要在實驗前或是實驗適應期間對實驗參數進行調試，本次實驗需要設定的參數如下:(1)訓練通道(可最多選擇四路同時進行)；(2)訓練間隔時間；(3)條件刺激時長；(4)非條件刺激時長；(5)條件刺激(音頻)頻率；(6)條件刺激時間間隔；(7)非條件刺激電流強度；(8)訓練次數。

系統軟件提供了動物穿梭狀況的波形圖窗口。通過這個窗口可以得到動物每次穿梭的時間點，波峰表示大鼠在A室，波谷表示動物在B室，波形發生翻轉，則表示大鼠發生了穿梭行為，系統通過分析可自動計算大鼠行為成功率。大鼠每次穿梭都在波形圖中有相應的時間點對應，可分析動物反應時間，實驗數據也更加全面細致。

箱體頂部配以高清攝像頭，采集到的圖像單個像素流明值范圍為0～255，采樣范圍為A、B箱室，采樣速率為每秒5張。實驗開始時設定參數，標定樣張，放入實驗大鼠后，以每秒5張速率采樣，將采樣圖片與樣張對比，采樣圖片中的大鼠會改變圖片中其所在位置的流明值，兩者比較，計算出采樣圖片與樣張相比流明值變化最大的地方，即為采樣圖片中大鼠的位置。把圖片分為A、B兩區域，將圖片中大鼠位置與之照應，即可確定大鼠在采樣圖片時所處的位置。播放音頻時，記錄大鼠位置，播放完畢后，記錄大鼠位置，通過前后位置對比，結合音頻種類，可自行判斷大鼠行為正確與否，如果行為錯誤，上位機發送特定字符串給單片機，單片機讀碼后控制繼電器閉合，使得大鼠當前所在區域刺激電路接通，大鼠遭受電擊懲罰，大鼠為躲避電刺激穿梭到對側區域，此過程稱為被動回避反應(passive avoidance response，PAR)或逃避反應(escape response，ER)。條件刺激過后，單片機控制繼電器斷開，結束通電刺激。如果在音頻播放停止之前發生穿梭行為，即發生了主動回避反應(active avoidance response，AAR)[10-11]。

1.2.5 場景恐懼(fear-condition)實驗

嚙齒類動物在恐懼時會表現出特有的凝滯狀態(freezing)，包括暫時抑制除呼吸運動外的所有的身體運動[12]。本裝置可進行場景恐懼實驗，通過對程序的更改和設備調試，測試了環境更換對大鼠場景恐懼實驗反射模式的影響。本裝置可以用隔板將左右箱室隔開，僅用一個箱室配合足底電刺激金屬柵桿、頂部攝像頭、實驗程序便可以完成場景恐懼實驗。實驗程序需要更改的部分包括:(1)改變雙音頻訓練邏輯，將危險音頻信號播放概率調為100%；(2)將調整訓練間隔時間、條件刺激時長、非條件刺激時長、訓練次數，使之與場景恐懼實驗訓練要求相匹配。訓練開始后，觀察主界面中穿梭箱內實時畫面，統計實驗動物在條件刺激響起過程中、條件刺激間隔過程中的凝滯時間，計算凝滯時長占總實驗時間的比率。

1.2.6 明暗箱實驗

本實驗裝置可將一側的箱室換為透明亞克力板，并加裝白熾燈，實驗時保持常亮狀態。撤除一切條件刺激、非條件刺激，實驗進行時通過主界面監控箱體內老鼠狀態，統計實驗動物在設定時間內穿梭次數以及分別在明箱的滯留時間。

1.3 實驗方法

1.3.1 穿梭箱單音頻訓練

實驗主要參數如下:(1)訓練通道1(可最多選擇四路同時進行)；(2)訓練間隔時間為24 h；(3)條件刺激時長7 s；(4)非條件刺激時長15 s；(5)條件刺激(音頻)頻率8 kHz；(6)條件刺激間隔25 s；(7)非條件刺激電流強度5 mA；(8)訓練次數50次。點擊標定按鈕，將穿梭箱內部流明值存入系統，實驗裝置即設定完成。

將動物放入穿梭箱內，按照程序設定適應時間讓其適應環境，期間不施加任何刺激。適應完成后，播放音頻，播放完畢0.1 s內系統判斷動物所在位置，如果與初始位置相同，通電刺激；如果與初始位置不相同，則不通電。每天連續重復過程50次，持續7 d。

1.3.2 穿梭箱雙音頻訓練

按照傳統單音頻訓練方法訓練4 d后，改為低音頻訓練。將條件刺激頻率改為2 kHz，改變程序邏輯，低頻音播放完畢，判定大鼠是否穿梭，如果大鼠穿梭到對側區域，則通電刺激，如果大鼠滯留于當前區域，則不通電，其余參數不變，持續2 d。

后改用雙音頻訓練，高低音頻出現概率各50%，條件刺激(音頻)頻率為8 kHz高頻音，2 kHz低頻音；其余參數不變，訓練持續4 d。

1.3.3 場景恐懼實驗

取實驗動物5只，訓練第1天，將大鼠放入改裝后的裝置內適應5 min。適應時間結束后給聲音刺激20 s，聲音結束后給電刺激8 s，電流大小5 mA，電刺激結束后等待200 s，這樣為一個訓練周期，總共訓練6個周期。觀察整個訓練過程內小鼠的狀態，記錄200 s間隔時間內凝滯時間、聲音刺激20 s內凝滯時間，電刺激后的20 s內的凝滯時間。第2天將小鼠放入長方形箱子中(80 cm×60 cm×40 cm)，不施加電刺激，訓練開始后給20 s聲音刺激，后觀察200 s，繼續給聲音刺激，觀察200 s，總共循環訓練3次，記錄200 s間隔得小鼠的凝滯時間和20 s聲音刺激中的凝滯時間。第3天，將大鼠放回原裝置內，不施加任何刺激，8 min后取出，記錄8 min內大鼠凝滯時間。

1.3.4 正常動物與習得場景恐懼模型動物對比實驗

將動物隨機分為兩組，每組5只。用隔板將裝置從中間隔開，改變程序訓練邏輯，使得裝置底部每間隔50 s通電10 s，通電電流5 mA，將一組訓練動物依次置于裝置一側20 min，使該組大鼠總共受到20次不可回避電刺激，從而建立一組習得場景恐懼記憶的動物模型[1]。另一組動物置于裝置內但不通電，20 min后取出。

更改程序訓練邏輯，訓練間隔設為12 h，非條件刺激時長7 s，其余參數與傳統單音頻穿梭箱訓練方法一致，兩組動物總共訓練12次，統計訓練成功率。

訓練12次完成后，將訓練裝置用隔板隔開，將兩組動物分別置于裝置一側進行場景恐懼實驗，測試時間5 min，統計兩組大鼠僵直時間。

2 實驗結果

2.1 穿梭箱單音頻訓練結果

學習成功率＝動物成功躲避電擊次數/總實驗次數，系統軟件可以直接計算出高音頻訓練、低音頻訓練、高低音頻混合訓練的成功率。成功率統計圖表如圖4(n＝4)。

大鼠實驗成功率直接體現了大鼠的學習效率，是實驗結果的重要參數。設定成功率穩定在70%以上即認為實驗達到預期成功率[13-14]。通過實驗數據可以看到，采用該種訓練系統后大鼠的學習成功率整體呈上升趨勢，第1天與第2天訓練成功率存在顯著的統計學差異(P＝0.0166)，第3天訓練結果與第1天存在極顯著的統計學差異(P＝0.0032)，之后每一天成功率均上升且與第一天存在顯著的統計學差異。在實驗第6天大鼠平均成功率均值達到70%以上，并在之后的實驗中保持在80%以上，即系統設計達到要求。訓練成功的實驗動物可進一步做神經、藥理等科研項目。

圖4 傳統單音頻訓練成功率統計圖Figure 4 Traditional single audio training success rate statistics chart

2.2 穿梭箱雙音頻混合訓練結果

在10 d的訓練周期中，前4 d進行高頻音訓練，第5、6天進行低頻音訓練，最后4 d進行高低頻音混合訓練。由4只老鼠成功率均值統計結果可以看到，前4 d高頻音訓練，大鼠訓練成功率在逐漸增長。第5天開始切換為低頻音訓練，大鼠成功率明顯提升。在第7～10天混合音頻訓練中，訓練成功率稍有回落，但在第9天成功率能夠超過70%，并且之后能夠維持在80%，該系統符合實驗設計要求[15-17]，見表1。

2.3 場景恐懼實驗結果

第1天的訓練使大鼠逐步建立起場景恐懼記憶。第2天僅給聲音刺激信號，大鼠能夠在受到聲音刺激的20 s內、200 s的間隔時間中表現出凝滯狀態，說明大鼠已經習得聲音的恐懼記憶，在第3天放入原實驗裝置后，在8 min的測試時間里大鼠平均凝滯時間能達到150 s，說明大鼠已經建立起場景恐懼記憶，系統符合場景恐懼實驗要求，3 d的場景恐懼實驗結果如圖5所示(n＝5)。

2.4 正常動物與習得場景恐懼模型動物對比實驗結果

由實驗結果可知，正常大鼠訓練成功率隨訓練次數增加而逐漸增長，而經不可回避電刺激的大鼠訓練成功率未呈現線性變化，成功率一直在20%以下。模型動物和正常動物在第3、5、6次訓練成功率出現顯著的統計學差異(P值分別為0.0488、0.0103、0.0114)，正常動物自第7次訓練開始成功率皆與模型組動物呈現極顯著統計學差異，說明不可回避電刺激嚴重影響了動物主動回避學習行為，正常動物與模型組動物12次穿梭箱訓練結果如圖6所示(n＝10)。

表1 雙音頻混合訓練成功率(±s，n＝4)Table 1 Dual audio mixing training results

表1 雙音頻混合訓練成功率(±s，n＝4)Table 1 Dual audio mixing training results

組別Groups Day1成功率Success rate Day2成功率Success rate Day3成功率Success rate Day4成功率Success rate Day5成功率Success rate Day6成功率Success rate Day7成功率Success rate Day8成功率Success rate Day9成功率Success rate Day10成功率Success rate高頻音High frcqucncy audio training(13±2)%(25±4)%(42±6)%(57±2)% - - - - - -低頻音Low frcqucncy audio training---- (80±3)%(90±5)% - - - -混合組Mixing training - - - - - - (54±9)%(59±4)%(74±7)%(81±4)%

圖5 凝滯時間統計結果Figure 5 Freezing time statistics

注:圖中12組數據依次代表大鼠12次穿梭箱訓練結果。與正常大鼠對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。圖6 正常大鼠與習得場景恐懼記憶大鼠對比實驗結果Note.The twelve groups of bars in the figure show the results of 12 shuttle box training sessions in rats.Compared with normal rat groups，*P＜0.05，**P＜0.01.Figure 6 Comparison of experimental results between normal rats and learned contextual fear memory rats

注:圖中兩列數據代表場景恐懼實驗大鼠的凝滯時間。與正常大鼠對照組比較，**P＜0.01。圖7 正常大鼠與習得場景恐懼記憶大鼠場景恐懼實驗結果Note.The bars in the figure show the freezing time of fear-condition test in rats.Compared with normal rat group，**P＜0.01.Figure 7 Results of fear-condition test in normal rats and learned contextual fear memory rats

圖7為兩組動物場景恐懼實驗結果對比，由訓練結果可知，經12次穿梭箱訓練后，模型組動物的凝滯時間與正常動物相比存在極顯著的統計學差異(P＝0.00056)，綜合圖6所示的模型組動物訓練成功率顯著降低，說明動物已經建立場景恐懼記憶，模型組動物和正常動物經本裝置訓練能夠在穿梭箱實驗和場景恐懼實驗中體現出顯著性差異，說明本裝置和開源系統的設計符合動物行為學實驗要求。

3 討論

單音頻訓練結果符合預期[18]，訓練結果從第2天開始出現統計學差異，第3天訓練結果出現顯著的統計學差異，證明本裝置可以進行傳統的穿梭箱實驗。雙音頻訓練結果在切換訓練方式時有明顯的波動。雙音頻混合訓練第5、6天的訓練成功率有明顯的提升，主要原因是大鼠在危險環境中有一定的恐懼感，在沒有非條件刺激時，更傾向于選擇保持現狀，低頻音響起后，滯留于當前區域為正確行為，一定程度上契合了動物習性，成功率也相對較高。第7天的訓練成功率稍有回落，是由于高低音頻混合訓練使得訓練難度加大，大鼠需要適應，在第9天成功率能夠上升至74%，說明大鼠能夠成功分辨兩種聲音，該系統符合穿梭箱試驗設計的基本實驗要求。從正常動物與習得場景恐懼記憶動物對比實驗中可知，施加不可回避電刺激的大鼠在穿梭箱實驗和場景恐懼實驗結果中均與正常大鼠有顯著性差異。施加不可回避電刺激、穿梭箱訓練、場景恐懼訓練均可在同一裝置同一系統內完成，體現出開源系統良好的適配性。且相同的實驗裝置在重慶科技學院和陸軍軍醫大學使用時所作出的實驗數據類似，表明該實驗系統作為一種標準的實驗系統可以全面推廣。

動物行為學實驗的各種產品之間制造標準不統一，在材質、刺激標準、數據收集、處理以及實驗方法等方面都有一定的差異，不同實驗之間難以實現交叉。而開源實驗系統可以極大程度地兼容各類軟件硬件，使得不同項目之間可以依托本程序平臺為基礎，靈活運用不同硬件實現兼容運行，所以開源實驗系統能在統一實驗標準方面做出極大的貢獻[19-20]。

借助開源系統適配性廣的優勢，本系統能夠提供多種模態的刺激，系統可滿足多種大鼠神經科學實驗需求，提供多模態刺激(聲、光、電等)，可測試不同的感官刺激對大鼠神經系統和行為決策的影響，并且每種模態可提供不同強度的刺激信號(如高低音刺激源，強弱光刺激源等)，可測試大鼠對不同程度刺激的反應以及學習能力。系統底層代碼完全開源，可根據實驗需求自行調整，整個實驗流程由計算機自動控制實驗進程，收集實驗數據，實現全控化實驗，系統設計合理，性能穩定，減少了大量重復性勞動，方便研究人員使用，有利于系統的廣泛推廣，加快系統升級。我們致力于將簡單的動物實驗系統開源化、規范化，也希望更多的科研工作者能夠加入我們，打破技術壟斷，真正惠利于所有科研工作者。