培養條件對西洋參不定根誘導的影響

李潤田 劉志琨 鄒丹 張宗申

摘 要： 為了提高西洋參不定根的誘導率和生長速度，該研究以西洋參鮮根為外植體，在基本培養基的基礎上優化IBA、碳源、氮源和磷源等營養成分。結果表明：西洋參不定根誘導過程可以明顯分為外植體脫分化（愈傷化）、再分化（根形成）和根伸長等三個階段;MS基本培養基更有利于西洋參不定根的誘導，可能與MS培養基中礦質元素含量高有關;當培養基中IBA濃度達到2 mg·L-1時，外植體表面上不定根分布密度大，誘導率達到（96±3.5）%;培養基中添加蔗糖到30 g·L-1時，不定根的誘導效果最好，但繼續提高濃度后不定根變短、直徑變粗;培養基中NO3-∶NH4+和 PO43- 濃度分別為20∶ 10（總氮量30 mmol·L-1）和25.0 mmol·L-1時，西洋參不定根誘導率達到最大。結果提示優化培養條件可以顯著改善西洋參不定根的誘導和生長，為后續西洋參不定根規?；囵B提供理論支持。

關鍵詞： 西洋參， 不定根， 培養基優化， 誘導， IBA

中圖分類號： Q945 ?文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2020）04-0557-10

Abstract： This study reported the improved induction rate and growth speed of Panax quinquefolium adventitious roots cultured on the basal media supplemented with varying IBA， sucrose， NO3-∶NH4+ ratio and PO43-， etc. The results were as follows： In the whole process of adventitious root induction， three main phases could be distinguished including dedifferentiation （callus formation）， redifferentiation （initiation of adventitious root）， and elongation of roots. And it achieved the best induction of adventitious roots from explants cultured on the MS containing high concentration of mineral elements， which probably fulfilling the requirement for nutrients at stage of callus formation. Amid experiments of IBA， at a concentration of 2 mg·L-1 was the most effective in inducing adventitious roots with （96±3.5）% of induction rate， at which dense distribution of adventitious roots on the surface of callus could be observed. Additionally， 30 g·L-1 sucrose was proved to be the optimal concentration， however， it would grow into stubbly roots upon the increase of sucrose concentration. Furthermore， the effect of NO3-∶NH4+ ratio and PO43- concentration on adventitious root induction was also evaluated. The maximum induction rate was obtained in 20∶10 ratio of NO3- to NH4+ （total N source of 30 mmol·L-1） and 25.0 mmol·L-1 PO43-， respectively. The present data suggest that modification of media ingredients can significantly enhance the induction and growth of P. quinquefolium adventitious roots， which would provide theoretical support for following large-scale culture of P. quinquefolium adventitious roots.

Key words： Panax quinquefolium， adventitious roots， optimization of media， induction， IBA

西洋參（Panax quinquefolium）是五加科人參屬（Panax L.）的多年生草本藥用植物，其宿根一直是該屬天然藥物的重要來源（Yang et al.， 2014）。西洋參除了具有清熱解毒、滋陰補腎和口齒生津的功效外，還具有降血糖、促進血液循環的作用，有助于人體抗衰老、提高免疫力和保護心血管系統等（李珊珊和孫印石， 2017; Huang et al.， 2019）。鑒于我國將西洋參列入新食品原料目錄管理，隨著其在食品領域的廣泛應用，它的市場需求量將會急劇增加。

種植的西洋參受生長環境、氣候、土壤及栽培技術等因素的影響很大，也存在著“重、毒、副”殘留與基本農田爭地和管理成本高等突出問題，而且一般還要經過4到5年的生長周期才能收獲入藥（Li et al.， 1996; 陳洪海和張志華， 2014）。因為西洋參以根入藥， 通過不定根離體培養技術生產西洋參培養物，可以作為替代大田栽培資源提取天然產物的原料（Murthy et al.， 2018）。不定根離體培養的工藝流程包括不定根誘導、固體增殖擴繁和懸浮級聯放大培養等技術環節，其中高效誘導是實現不定根規?；a的前提（Jeong et al.， 2009; Zhang et al.， 2017）。對于西洋參等多年生藥用植物，一般采用其宿根作為不定根誘導的外植體，但是普遍存在著細胞脫分化難、次生代謝物質抑制生長、對外源激素敏感性低甚至易發生褐變致死等問題，直接導致外植體上不定根誘導率較低（Zhao et al.， 2013）。目前，雖然開展了西洋參不定根離體培養的研究，但僅限于不定根懸浮培養的生長和總皂苷積累等方面，主要集中在誘導子應用、培養形式和不定根增殖等問題上（李慧娟等， 2011; Yu et al.， 2016）。目前，對于影響西洋參不定根誘導發生的因素及解決手段等方面的研究還未見文獻報告，而對該問題的研究有利于建立穩定的西洋參不定根誘導工藝。

為了提高西洋參不定根的誘導率，本文以新鮮的西洋參根為外植體，篩選適合西洋參不定根誘導的基本培養基和優化主要成分的添加濃度。研究結果對后續西洋參不定根培養的商業化應用提供基礎性數據，同時也為其他珍稀瀕危藥用植物資源可持續利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

吉林長白山三年生的新鮮西洋參根。先將西洋參根經自來水沖洗、濾紙吸干、消毒等處理，然后將其剪為1～2 cm的切段，作為誘導不定根的外植體，待用。

1.2 方法

1.2.1 基本培養基的選擇 將外植體切段分別接種在含有1/2 B5、B5、MS、1/2 MS的固體培養基上（pH6.0），輔以2%蔗糖+0.5%瓊脂粉+3 mg·L-1 IBA。在25 ℃條件下暗培養，以誘導率為指標確定最適培養基。

1.2.2 吲哚丁酸（IBA）濃度對西洋參不定根誘導效果的影響 以MS為基本培養基，添加2%蔗糖+0.5%瓊脂粉，分別添加不同濃度的IBA（0.05、0.10、0.20、1.00、2.00、4.00 mg·L-1），pH值6.0，將處理的外植體切段接入，其余同1.2.1。

1.2.3 碳源濃度對西洋參不定根誘導的影響 以MS+2 mg·L-1IBA+0.5%瓊脂粉為培養基配方，添加不同濃度的蔗糖（15、25、30、40 g·L-1），pH值 6.0，接種后培養，其余同1.2.1。

1.2.4 氮源對西洋參不定根誘導的影響 以MS+30 g·L-1蔗糖+2 mg·L-1 IBA +0.5%瓊脂粉等作為基本培養基配方，按照表1添加不同比例的NO3- ∶NH4+，培養基中總氮量固定為30 mmol·L-1，培養基pH6.0，外植體接種后培養，其余同1.2.1。

1.2.5 PO43-對西洋參不定根誘導的影響 以MS（NO3-∶NH4+為20∶10）+30 g·L-1蔗糖+2 mg·L-1 IBA+0.5%瓊脂粉為培養基組成配方，添加不同濃度的PO43-（5、10、15、20、25、30 mmol·L-1），培養基pH6.0，外植體接種后培養，其余同1.2.1。

1.2.6 數據統計與分析 上述所有試驗均隨機分組，設置3組重復，每組總接種數量為50個外植體;從接種第4天開始，每天觀察外植體變化及不定根發生情況，并以培養28 d的不定根誘導結果計算誘導率，實驗數據采用Microsoft Excel 2010和Origin 2017進行分析，P<0.05差異顯著。不定根誘導率=（發生不定根的外植體數/外植體總數）×100%

2 結果與分析

2.1 基本培養基的選擇

通過觀察不定根發生情況確定適合西洋參不定根誘導的基本培養基類型，結果如圖版Ⅰ所示。在接種培養7 d后，外植體的切口端（傷口）出現膨脹等愈傷化現象;隨著時間延長，愈傷組織表面逐漸呈現顆粒狀;在培養20 d后，愈傷組織表面陸續分化出不定根。從誘導培養28 d后的不定根誘導率統計結果（圖1）可以看出，MS更適合不定根誘導，B5的效果較差。這可能與不定根發生過程中涉及愈傷組織中細胞脫分化、分裂、生長等有關，因為這些細胞變化需要活躍的生物物質代謝、能量代謝以及細胞的重構等，必須提供充足的營養元素才能滿足上述細胞活動。MS培養基的最主要特點就是礦質元素和其他營養成分含量高，與不定根誘導過程對營養成分的需求相一致，本結果也證明了這個推測。

2.2 吲哚丁酸（IBA）濃度對西洋參不定根的誘導效果

培養基中IBA濃度對西洋參不定根的誘導情況及誘導率統計結果分別如圖版Ⅱ和圖2所示。通過比較發現，當濃度較低時，外植體上發生較多愈傷組織，表面上不定根數量少且短（圖版Ⅱ：A，B，C）;當IBA濃度較高時，不定根誘導發生的效果較好，不定根分布密度大且不定根較長（圖版Ⅱ：D， E，F）;當IBA濃度高于1 mg·L-1時，外植體上不定根誘導率達到（82±3）%以上，2 mg·L-1時不定根誘導率達到（96±3.5）%。綜合考慮誘導率和培養基成本，在后續的試驗中選擇2 mg·L-1 IBA作為添加濃度。

2.3 碳源濃度對西洋參不定根的誘導效果

在離體條件下，培養基中添加碳源除了為不定根誘導提供能量外，還對培養基滲透勢有很大影響，因此其添加濃度是非常重要的參數。根據前面結果，在MS+2 mg·L-1 IBA+0.5%瓊脂基本配方中添加不同濃度的蔗糖，28 d后觀察統計外植體上不定根的發生和誘導率（圖版Ⅲ和圖3）。結果表明，盡管在所有蔗糖濃度的培養基中，外植體上都能發生愈傷組織，但是不定根發生情況差異很大。當糖量為30 g·L-1時，西洋參不定根誘導率較大;當糖量較低時（15 g·L-1），西洋參不定根誘導率較低;當蔗糖濃度達到40 g·L-1時，雖然不定根發生率相對較高，但不定根較短，說明高濃度蔗糖具有抑制生長的作用， 這可能與糖量過高引 A. 1/2 B5培養基，愈傷組織表面上不定根較少; B. B5培養基，不定根密度比1/2 B5培養基中的增加; C. 1/2 MS培養基，愈傷組織表面的不定根數量明顯增加; D. MS培養基，不定根密度和根長度最大。

2.4 NO3- ∶NH4+對西洋參不定根的誘導效果

在MS+30 g·L-1蔗糖+2 mg·L-1IBA+0.05 mg·L-1NAA+0.5%瓊脂基礎上，改變NO3- ∶NH4+配比，培養28 d后觀察、統計西洋參不定根發生情況如圖版Ⅳ和圖4所示。當NO3-所占比例低時，外植體愈傷化較好，不定根發生率也較高，但不定根較短即生長速度漫;當NO3-所占比例逐漸升高時，不定根密度增加，不定根越來越長即生長速度越來越快，NO3-所占比例過大（超過28∶2）時，盡管不定根較長，但分布密度降低，不定根衰老較明顯。上述結果提示，NO3- ∶NH4+影響不定根的發生、生長和生理狀態。A. 0.05 mg·L-1; B. 0.10 mg·L-1; C. 0.20 mg·L-1; D. 1.00 mg·L-1; E. 2.00 mg·L-1; F. 4.00 mg·L-1。

2.5 PO43-濃度對西洋參不定根的誘導效果

磷元素是植物細胞分裂、分化和生長發育必須的大量元素之一。MS培養基中磷元素以PO43-的形式存在，其濃度高低直接影響著外植體上不定根誘導發生。將西洋參外植體接種在含不同濃度PO43-的培養基中，培養28 d后不定根發生情況如圖版Ⅴ和圖5所示。當PO43-濃度較低時，不定根誘導率較低，生長速度慢;隨著濃度升高，不定根密度逐漸增加，到15 mmol·L-1時不定根生長明顯加快;當PO43-濃度達到25 mmol·L-1時，不定根的生長速度和分布密度基本不再變化。A. 15 g·L-1; B. 25 g·L-1; C. 30 g·L-1; D. 40 g·L-1。

3 討論

本研究通過篩選基本培養基和優化NO3-∶NH4+比以及IBA、蔗糖和PO43-等培養基成分，均顯著提高了西洋參外植體的不定根誘導率和生長速度，在優化條件下不定根誘導率最高值達到（96+3.5）%。上述結果為西洋參不定根的固體增殖擴繁、縮短不定根種子制備周期等提供了依據，對于下階段建立西洋參不定根懸浮培養體系奠定了基礎。

添加外源IBA對不定根的誘導發生起關鍵作用。一些研究表明，IBA在植株水平上誘導根器官A. 0∶30; B. 4∶26; C. 8∶22; D. 12∶18; E. 15∶15; F. 20∶10; G. 24∶6; H. 28∶2; I. 30∶0。

形成的活力很強，如擬南芥和玉米的不定根發生以及側根形成等（Ludwig-Muller et al.， 2005; Strader et al.， 2011; Yadav et al.， 2013; Schlicht et al.， 2013）;其在離體條件下也起類似的生理作用，如促進東哥阿里和貫葉金絲桃不定根的形成（Cui et al.， 2010;Tao et al.， 2015）。對于IBA誘導不定根或側根發生的機理，一些研究發現IBA是IAA依賴性的，必須在細胞內轉化為IAA形式才具有生理活性（Zoman et al.， 2000）;也有結果證明IBA可能有獨立于IAA的作用機制，依靠自己的信號傳遞途徑激發下游的生理生化事件（Strader et al.， 2011）。本文結果顯示IBA不但具有較好的西洋參不定根誘導效果，而且還具有IBAA. 5 mmol·L-1; B. 10 mmol·L-1; C.15 mmol·L-1; D . 20 mmol·L-1; E. 25 mmol·L-1; F. 30 mmol·L-1。

濃度依賴性的特征。在離體條件下，不同外植體對外源IBA的敏感性，存在著種質特性、生理狀態、組織幼嫩程度和環境條件等造成的差異性，這些差異影響著外植體對外源IBA的吸收效率、轉運速度和IAA轉化等（Woodward & Bartel， 2005）。因此，在進行外植體誘導不定根的試驗中，首先要根據外植體的具體情況優化并確定IBA使用濃度，以提高不定根誘導效率和縮短不定根種子制備周期。

基礎培養基及其他營養成分對不定根誘導具有很大影響。由于基本培養基的大量元素和微量元素的組成特點有所不同，其應用范圍和使用目的也有差異（齊琳琳等，2017）。從外植體經過愈傷組織途徑發生不定根，涉及到外植體細胞脫分化、再分化等過程，細胞顯微結構和形態以及生理生化代謝能力和方式等都發生一系列變化（Benková et al.， 2003;Ma s'lanka & Bach， 2014; Li et al.， 2018）。而MS基本培養基具有無機鹽含量高的特點，符合不定根誘導及生長對營養元素的要求，本文結果也證明了MS培養基比較適合西洋參不定根誘導，與前人結論一致（ Lee & Paek， 2012）。同時，本文結果也說明了NO3-∶NH4+、糖和PO43-濃度等對西洋參不定根誘導率具有很重要的影響。一方面是因為從外植體組織到不定根轉化過程中涉及細胞重構和生物大分子代謝等需要大量營養成分參與的過程，而且糖等物質還有調節培養基滲透勢的作用，直接影響外植體細胞對營養成分的吸收利用;另一方面，NO3-∶NH4+對植株或離體根系的形態建成通過氮元素轉化效率、NO信號分子形成等發揮特殊作用（Pagnussat et al.， 2002; Zhao et al.， 2007; 楊雨迎等， 2018）。因此，本文在篩選基本培養基的基礎上進一步優化了NO3-∶NH4+比等營養成分，初步實現了西洋參不定根高效誘導，證明營養成分及其濃度對不定根發生具有重要作用，可以與IBA等一起發揮協同作用。

盡管利用不定根培養技術在少數種類的藥用植物中獲得突破，但是對于大多數藥用植物來說仍然存在限制性因素，主要包括不定根誘導率低、懸浮下生長慢、有效成分含量不穩定等 （Murthy et al.， 2008; Lee & Paek， 2012; Murthy et al.， 2018）?；诖?，在本研究基礎上，下一步需要在基于生物反應器規?；瘧腋∨囵B工藝方面深入研究，比如溶氧、供氧方式及養分代謝動力學等重要參數，實現西洋參不定根生物量和活性成分積累等關鍵技術指標的突破，解決影響西洋參不定根規模化培養過程中的核心問題。

參考文獻：

BENKOV E， MICHNIEWICZ M， SAUER M， et al.， 2003. Local， efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation[J]. Cell， 115（5）：591-602.

CHEN HH， ZHANG ZH， 2014. Cultivation and analysis on the technique of high yield cultivation of Panax quinquefolium in area of Changbai Mountain [J]. Agric Technol， 34（11）：134.[陳洪海， 張志華， 2014. 長白山區西洋參種植及高產栽培技術分析[J]. 農業與技術， 34（11）：134.]

CUI XH， CHAKRABARTY D， LEE EJ， et al.， 2010. Production of adventitious roots and secondary metabolites by Hypericum perforatum L. in a bioreactor[J]. Bioresour Technol， 101（12）：4708-4716.

HUANG X， LIU Y， ZHANG Y， et al.， 2019. Multicomponent assessment and ginsenoside conversions of Panax quinquefolium L. roots before and after steaming by HPLC-MS [J]. J Ginseng Res， 43（1）：27-37.

JEONG JA， WU CH， MURTHY HN， et al.， 2009. Application of an airlift bioreactor system for the production of adventitious root biomass and caffeic acid derivatives of Echinacea purpurea[J]. Biotechnol Bioproc Eng， 14（1）： 91-98.

LEE EJ， PAEK KY， 2012. Enhanced productivity of biomass and bioactive compounds through bioreactor cultures of Eleutherococcus koreanum Nakai adventitious roots affected by medium salt strength[J]. Ind Crops Products， 36（1）：460-465.

LE SS， SUN YS， 2017. Research achievements on structures and activities of polysaccharides from Panax quinquefolius[J]. Spec Wild Econ Anim Plant Res， 39（3）： 68-71.[李珊珊， 孫印石， 2017. 西洋參多糖結構與藥理活性研究進展[J]. 特產研究， 39（3）：68-71.]

LI HJ， PIAO XC， FEI LK， et al.， 2011. Several factors affecting proliferation of adventitious root in vitro and ginse-noside production of Panax quinquefolium [J]. J Agric Sci Yanbian Univ， 33（2）：77-88. [李慧娟， 樸炫春， 費麗坤， 等， 2011. 影響西洋參不定根組培增殖的幾種因素及皂苷生產的研究[J]. 延邊大學農學學報， 33（2）：77-88.]

LI K， LIANG YQ， XING LB， et al.， 2018. Transcriptome analysis reveals multiple hormones， wounding and sugar signaling pathways mediate adventitious root formation in apple rootstock[J]. Int J Mol Sci， 19（8）：1-13.

LI TSC， MAZZA G， COTTRELL AC， et al.， 1996. Ginsenosides in roots and leaves of American ginseng[J]. J Agric Food Chem， 44（3）：717-720.

LUDWIG-MULLER J， VERTOCNIK A， TOWN CD， 2005. Analysis of indole-3-butyric acid-induced adventitious root formation on Arabidopsis stem segments[J]. J Exp Bot， 418（418）： 2095-2105.

MA S'LANKA M， BACH A， 2014. Induction of bulb organogenesis in in vitro cultures of tarda tulip （Tulipa tarda Stapf.） from seed-derived explants[J]. In Vitro Cell Dev Biol-Plant， 50（6）：712-721.

MURTHY HN， DANDIN V， PARK SY， et al.， 2018. Quality，safety and efficacy profiling of ginseng adventitious roots produced in vitro[J]. Appl Microbiol Biotechnol， 102（17）：7309-7317.

MURTHY HN， HAHN EJ， PAEK KY， 2008. Adventitious roots and secondary metabolism[J]. Chin J Biotechnol， 24（5）： 711-716.

PAGNUSSAT GC， SIMONTACCHI M， PUNTARULO S， et al.， 2002. Nitric oxide is required for root organogenesis[J]. Plant Physiol，129（3）：954-956.

QI LL， LI G，LIU ZW， et al.， 2017. Effects of culture conditions on the growth and accumulation of saponin in Panax notoginseng callus[J]. Guihaia， 37（8）：1035-1042 .[齊琳琳， 李剛， 劉志偉， 等， 2017. 培養條件對三七愈傷組織生長和皂苷積累的影響[J]. 廣西植物， 37（8）：1035-1042.]

SCHLICHT M，LUDWIG-MULLER J， BURBACH C， et al.， 2013. Indole-3-butyric acid induces lateral root formation via peroxisome-derived indole-3-acetic acid and nitric oxide[J]. New Phytol， 200（2）：473-482.

STRADER LC， WHEELER DL， CHRISTENSEN SE， et al.， 2011. Multiple facets of Arabidopsis seedling development require indole-3-butyric acid-derived auxin[J]. Plant Cell， 23（3）：984-999.

TAO LL， PARK SY， IBRAHIM R， et al.， 2015. Production of biomass and bioactive compounds from adventitious roots by optimization of culturing conditions of Eurycoma longifolia in balloon-type bubble bioreactor system [J]. J Biosci Bioeng， 119 （6）： 712-717.

WANG MQ， GUILBERT LJ， LING L， et al.， 2001. Immunomodulating activity of CVT-E002， a proprietary extract from North American ginseng （Panax quinquefolium）[J]. J Pharm Pharmacol， 53（11）：1515-1523.

WOODWARD A， BARTEL B， 2005. Auxin： regulation， action， and interaction [J]. Ann Bot， 95（5）：707-735.

YADAV S， DAVID A， BALUKA F， et al.， 2013. Rapid auxin-induced nitric oxide accumulation and subsequent tyrosine nitration of proteins during adventitious root formation in sunower hypocotyls [J]. Plant Signal Behav， 8： e23196.

YANG WZ， HU Y，WU WY， et al.， 2014. Saponins in the genus Panax L. （Araliaceae）： A systematic review of their chemical diversity[J]. Phytochemistry， 106：7-24.

YANG YY， LUO HY， CAO F， et al.， 2018. Effects of NO3-/NH4+on the growth of hairy roots of Psammosilene tunicoide [J]. Mol Plant Breed， 16（5）：1698-1703.[楊雨迎， 雒懷宇， 曹芳， 等， 2018. NO3-/NH4+對金鐵鎖毛狀根生長的影響[J]. 分子植物育種， 16（5）：1698-1703.]

YU Y， ZHANG WB， LI XY， et al.， 2016. Pathogenic fungal elicitors enhance ginsenoside biosynthesis of adventitious roots in Panax quinquefolium during bioreactor culture [J]. Ind Crops Products， 94：729-735.

ZHANG Z， ZOU D， LIU M， et al.， 2017. Induction of Psammosilene tunicoides adventitious roots and the accumulation of triterpenoid saponins as affected by culture conditions[J]. Int J Agric Biol， 19（6）：1535-1540.

ZHAO DY， TIAN QY， LI LH， et al.， 2007. Nitric oxide is involved in nitrate-induced inhibition of root elongation in Zea mays [J]. Ann Bot， 100（3）： 497-503.

ZHAO XY， SU YH， ZHANG CL， et al.， 2013. Differences in capacities of in vitro organ regeneration between two Arabidopsis ecotypes Wassilewskija and Columbia [J]. Plant Cell Tiss Organ Cult， 112：65-74.

（責任編輯 周翠鳴）