杜仲SQS基因的特征信息分析

雷躍 楊仕梅 張天緣 趙德剛 宋莉

摘要：鯊烯合酶（SQS）是催化植物細胞合成甾醇和三萜類化合物的一種關鍵酶。為探明杜仲SQS基因家族成員的存在及其特性，本文通過生物信息學分析方法，對杜仲SQS基因（EuSQS）進行發掘，并對其進化關系、基因結構、保守基序、染色體定位、蛋白理化性質、空間結構、調控元件等進行分析。從杜仲基因組數據中獲得3條EuSQS基因，它們分布于不同的scaffold上，有5 ～6個外顯子;EuSQS蛋白含396～ 440 aa，相對分子質量為4573 ～ 4906 kDa，均屬于不穩定蛋白，主要由α-螺旋和無規則卷曲構成;EuSQS1和EuSQS3在結構上較為接近，二者與EuSQS2差異較大;除含有基本元件外，EuSQSs的順式作用元件還包括光照和激素響應、分生組織表達、逆境脅迫及類黃酮生物合成等六類;在進化關系上，杜仲EuSQSs與產膠植物橡膠草及橡膠樹的親緣關系較近。分析結果為進一步對EuSQS基因的功能鑒定和利用提供了依據。

關鍵詞：杜仲鯊烯合酶基因;萜類化合物;生物信息學;基因結構;功能預測

中圖分類號：Q8114

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2019）06-0001-07國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.06.001

Characteristic Information Analysis of Eucommia ulmoides SQS Gene

LEI Yue1，YANG Shi-mei1，ZHANG Tian-yuan1，ZHAO De-gang1，2，SONG Li1*

（1. Institute of College of Life Sciences and Agro-Bioengineering，Guizhou University/The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region （Ministry of Education）/ Guizhou Key Lab of Agro-Bioengineering，Guiyang，Guizhou 550025，China; 2. Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang，Guizhou 550006，China）

Abstract：Squalene synthase （SQS ）is a key enzyme catalyzing the formation of sterols and triterpenes in plant cellsIn order to explore the? existence and characteristics of the? SQS gene family members of? Eucommia ulmoidesthe Eucommia ulmoides SQS genes （EuSQSs ）were screened and further analyzed for a better cognition by bioinformatic analysis including phylogenetic evolution，gene structure，conserved motif，chromosome positioning，the physicochemical properties，spatial structure and regulatory elements etcThe results showed that three EuSQS genes scattering different scaffold were obtained from the genome data，which have 5-6 of exonsEuSQS proteins were composed of 396-440 aa with a relative molecular weight of 4573 ～ 4906 kDaThe main structure of α- helix and random coil were found in these unstable proteinsEuSQS1 and EuSQS3 are similar in structure，but they are quite different comparing with EuSQS26 types of cis-acting elements related to gene regulation including basic elements，photoresponse，hormone response，meristem expression，stress tolerance and flavonoid biosynthesis also were found in the EuSQS genesIn terms of evolutionary relationship，Eucommia ulmoides EuSQS is closely related to the Taraxacum kok-saghyz and Hevea brasiliensis based on the phylogenetic analysisThis study preliminarily revealed the EuSQS molecular characteristics，which laid a good foundation for further study on the function of EuSQS genes.

在城市化和工業化不斷發展過程中，土壤重金屬污染的問題逐漸凸顯，已對糧食安全構成嚴重威脅[1]。貴州省礦產資源豐富，磷礦、鋁礦開采和冶煉是貴陽市的支柱產業，上世紀80年代小煤礦無序開采產生的環境污染仍未得到有效治理。同時，城市周邊蔬菜產地養殖廢水灌溉普遍存在，以上所述都屬于典型的污染區域。研究表明：貴陽市周邊土壤存在重金屬污染[2]，工礦區土壤重金屬均高于其他功能區，如白云區工業園（以鋁工業為主）附近土壤重金屬含量都超過貴州省背景值[3]，貴陽市某養殖廢水污灌區土壤Cd嚴重超標[4]，花溪和烏當等地中Cd為特征污染元素[5]。貴陽市是喀斯特地質背景，碳酸鹽巖和黑色巖系等母巖風化的土壤，重金屬具有較高的本底值，屬于重金屬地球化學高背景區[6]。目前，對土壤重金屬污染現狀和評價研究較多，但對地質高背景下污染區農產品安全與農作物吸收富集規律的研究相對較少。

農產品中重金屬富集特征一直是國內外研究的熱點[7-8]，不同植物、相同植物不同品種對重金屬的吸收積累效應都存在差異，通常用富集系數來表征植物對重金屬的吸收及累積能力。何玉生等[9]對海口市四大蔬菜基地土壤-蔬菜系統重金屬富集研究發現：葉菜類蔬菜中Pb、Cd、Cr等含量明顯高于瓜果類;根據地上部Cd含量的顯著性，可篩選出重金屬低積累型的大白菜品種;蔬菜對不同重金屬的富集能力表現為Cd>As>Cu>Pb>Hg>Cr[10]。另有研究表明[11]：不同品種的蔬菜對Cr富集差異較大，Cd次之，Pb、As和Hg相對較小。目前，鎘米一直是土壤重金屬和食物鏈安全研究的焦點。稻米鎘超標除受土壤鎘含量的影響外，土壤pH是最大的影響因素。酸性條件會促進水稻根系對Cd的吸收，往往在土壤Cd未超標的情況下也會生產出鎘米。貴州省農產品重金屬超標現象屢見報道，多數與礦產資源開發與利用有關。

為探討地質高背景下典型污染區農產品重金屬污染狀況及安全風險，本研究選取貴陽市磷礦區、煤礦區、鋁礦冶煉區和養殖廢水灌溉區為研究區域，以沒有外源污染的區域作為對照，對研究區的土壤、蔬菜及水稻重金屬進行調查研究，為區域土壤重金屬污染防治、蔬菜和水稻安全生產提供科學依據。

1材料與方法

11樣品采集與處理

圖1是不同污染區域分布圖。以貴陽市各行政區（縣）為劃分規則，分別是：開陽縣磷礦區（KY），是典型的磷礦資源開采區域;花溪煤礦區（JA），花溪區麥坪鄉分布了很多小煤窯開采的廢棄礦洞，現仍然在持續排放酸性礦山廢水，沒有得到有效治理;白云區鋁礦冶煉區（BY），是中鋁貴州分公司和貴州鋁廠所在區域;烏當區養殖廢水灌溉區（WD），以養豬場排放的廢水作為灌溉水源;以清鎮市紅楓湖水上訓練基地作為對照區（QZ）。每個研究區采集10～16個土壤樣品，每個樣品采集 0～20 cm 耕層土壤，采用不均勻的“S”形布點法，不少于5個點的混合樣，用四分法取1～2 kg 后裝在布袋里，共采集62個土壤樣品。

以土壤樣品對應采集蔬菜樣品，包括蔥、蒜苗、辣椒、豇豆、豆角、黃瓜、南瓜、茼蒿菜、空心菜、白菜、茄子、小瓜、蘿卜、蘿卜菜、稻米等十多種農產品品種，按照其生物特性將其分為瓜果類、葉菜類和根莖類。帶回實驗室后，選取可食部分，用自來水和去離子水洗凈，晾干，放置于烘箱內85 ℃下殺青1 h，拿出樣品待其降至室溫后，放于烘箱70 ℃下至恒重（約3～4 h），粉碎后過60目篩，裝入自封袋內，編號，待測。

12樣品檢測方法與數據處理

土壤樣品采用王水進行水浴消解后測定;蔬菜樣品采用硝酸￣電熱板消解后測定;土壤和蔬菜待測液中重金屬含量均采用美國熱電Thermo電感耦合等離子體質譜儀X2（ICP￣MS）測定，整個分析過程所用試劑均為優級純（GR），實驗用水均為去離子水（DI water），所有玻璃器皿均在10%的硝酸中浸泡24 h以上。分析過程中采用空白樣、平行雙樣，設置3組平行，并使用國家植物標準物質（GSV￣2）對農產品中Cr、Cu、Zn、As、Cd、Pb濃度的分析測定進行質量控制。標準物質的回收率均在推薦值的95%～105%以內，土壤樣品加標回收率為 92%～105%，樣品回收率較好。所有數據均通過異常值檢驗篩選后采用Excel 2007、Origin80數據處理系統進行統計分析。

13土壤重金屬污染評價方法

運用綜合污染指數法中的內梅羅指數法[12]對各研究區進行環境風險評估，計算公式如下：

15富集系數（BCF）

富集系數（BCF）計算，是指植物體系某種重金屬含量與土壤中對應元素含量的比值[8]，可以反映出植物對土壤重金屬元素的累積能力。其計算公式為：

2結果與分析

21不同污染區土壤重金屬污染評價

通過對污染區土壤綜合污染指數評價（表1）可知：磷礦區、鋁礦冶煉區和煤礦區，綜合污染因子分別為118、117、134，達輕度污染水平。如圖2所示，磷礦區土壤重金屬Cd含量均值為046 mg/kg，對比農用地土壤污染風險篩選值（GB15618—2018），超標15倍，顯著高于對照區;鋁礦冶煉土壤主要受到附近赤泥堆的影響，赤泥滲透液造成該地土壤Cd及部分As超標。煤礦區土壤中Cu、Cd含量均值分別為8707、036 mg/kg，分別超標174和12倍（GB15618—2018），煤礦區Cu含量顯著高于其余研究區，土壤pH為426，與磷礦區、對照區存在極顯著差異（P<001），可能原因是該地水稻田灌溉水源自上游的酸性礦山廢水。該地土壤有機質含量均值達14037 g/kg，顯著高于磷礦區，與其余研究區無顯著差異。養殖廢水灌溉區土壤中土壤Pb含量顯著高于鋁礦冶煉區、煤礦區和對照區，土壤Cd、Zn含量均值為078和23119 mg/kg，Cd超標26倍（GB15618—2018），Cd、Zn含量均顯著高于其余研究區，其污染指數為201（表1），達到中度污染水平。

運用土壤環境質量標準（GB15618—2018）對污染區土壤進行類別劃分：Ⅰ類土壤為優先保護類，Ⅱ類土壤為安全利用類，Ⅲ類土壤為嚴格管控類。由表2可知，污染區土壤2個為Ⅲ類土壤外，其余45個土壤都屬于Ⅱ類土壤，表明各污染區土壤均受到重金屬污染。除Cr外，污染區土壤中其余重金屬元素都存在不同情況的點位超標，Cd為特征污染元素，總點位超標率達8085%。

22不同污染區蔬菜和水稻重金屬含量特征及污染評價

將研究區蔬菜按不同種類進行劃分后，對比食品中污染物限量標準（GB2762—2017）表明（見圖3），污染區各類蔬菜重金屬均值含量未超過食品中污染物限量標準，煤礦區稻米樣品中存在Cd、Cu、Zn超標的現象，說明當地利用礦山廢水灌溉農田存在一定的環境風險，不利于水稻的種植。該區域土壤Zn不超標的情況下稻米受到污染，有可能是水稻生長過程中根系分泌小分子有機酸，促進了根系的差異性。再者，該地土壤pH低至448，有機質高達14037 g/kg，說明土壤中有機質含量的增加對重金屬有效態含量具有促進作用。土壤酸化不僅是受煤礦開采的影響，也可能是黑色巖系風化的結果。有學者指出，黑色巖系風化過程會導致土壤pH過低[15]。

從單因子污染指數可以看出（表3），該批蔬菜中磷礦區辣椒和鋁礦冶煉區豆角存在Cd污染現象（Pcd≥1），污染的主要原因在于對應土壤Cd點位超標和部分瓜果類蔬菜對Cd的富集能力較強，其余蔬菜均未受到污染（Pi<1），處于安全生產水平，食用較為安全;同種蔬菜在不同的重金屬間單因子污染指數不同，不同種蔬菜在同種重金屬中的污染指數也不同，這是由于不同研究區土壤污染狀況不同以及蔬菜間的富集差異所致。根據綜合污染指數來看，除上述蔬菜受Cd 影響導致輕度污染外，其他品種蔬菜都在清潔范疇內。煤礦區稻米存在不同程度的污染，最大綜合污染指數達3983，單因子污染指數PCu﹥PCd﹥PZn﹥PPb﹥PAs﹥PCr，主要受到Cd、Cu、Zn的污染。利用目標危險系數法[16]（Target hazard quotient）模型計算出稻米中受污染元素Cd、Cu、Zn的THQ值分別為66、12、24，均大于1，表明3種元素對人體具有潛在健康風險。

23不同污染區蔬菜和水稻重金屬生物富集特性

富集系數（BCF）指植物體內某種重金屬含量與土壤中對應元素含量的比值[8]，可以反映出植物對土壤重金屬元素的累積能力。

由表4可知，各研究區的蔬菜對重金屬富集能力表現為Cd﹥Cu﹥Zn﹥As﹥Cr﹥Pb。從不同類型蔬菜對同種重金屬吸收來看，葉菜類和根莖類中的Cd、Zn、Cu、As、Cr 5種元素大多都高于瓜果類。對于Cd的富集能力而言，不同類型蔬菜間表現為葉菜類>根莖類>瓜果類，其余元素在蔬菜種類間無明顯規律。但賈麗等[17]對濟南菜地重金屬富集的研究中，表明重金屬Cd的富集能力順序為果菜類﹥葉菜類﹥莖菜類，與本研究不同。這可能是由于土壤的理化性質與土壤類型的不同，土壤理化性質主要是土壤酸化以及有機質含量不一帶來的影響。土壤類型不同，其土壤中各類物質的生理機制也不同，這些差異便會波動重金屬在蔬菜體內的富集效應。煤礦區（JA）的稻米富集能力強弱順序為Cd﹥Zn﹥Cu﹥Pb﹥Cr﹥As，與王碩等[18]的研究一致。

3討論與結論

31討論

各污染區土壤重金屬污染特征不同，Cd為特征污染元素，磷礦區屬于磷質石灰巖地質背景下Cd較高的土壤類型，加上磷礦開采產生的礦渣等是土壤重金屬污染的主要原因;而鋁礦冶煉區附近的赤泥堆在雨水沖刷下向土壤中滲漏，直接污染土壤，堿性廢水也導致土壤pH升高;而煤礦區污染源是礦山廢水的灌溉。查建軍等人[19]的研究表明，使用酸性礦山廢水灌溉農田，將會改變土壤結構變化和元素組成，是造成土壤重金屬污染的重要原因。重金屬生物有效性與土壤pH呈負相關，與有機質呈正相關[20]。本研究發現，由于酸性礦山廢水的影響，煤礦區稻田土壤pH平均值為426，重金屬生物有效性高，容易在土壤-作物系統中遷移。因此，稻米Cd、Cu、Zn超標倍數分別為67、11和15，THQ值均大于1，對人體具有潛在健康風險。本研究中，養殖廢水灌溉區土壤有大量鹽基離子積累，pH較高，重金屬累積嚴重，綜合污染指數最高，但生物有效性相對較低，重金屬富集系數均小于1，富集能力弱，該區域蔬菜樣品均未超標。

另外，不同類型蔬菜品種對同種重金屬的富集狀況不同，同類型蔬菜品種對不同種重金屬的富集狀況也有可能不同，Cd的富集能力最強，Pb的富集能力較弱。蔡寶新等[21]對云南農作物研究表明，玉米對Cd的富集明顯高于其他金屬元素，這是由于Cd在土壤中的移動能力較強，植物對其吸收能力也較強。相反，Pb在土壤中的移動能力較差，這可能是由于Pb在土壤中以化學吸附為主，在土壤中形成溶解度較小的沉淀。葉菜類蔬菜對Cd的富集明顯高于其他類型蔬菜。劉意章等[22]研究表明，最弱的

葉菜類蔬菜平均Cd含量（干重）高達115 mg/kg，葉類作物具有較大的葉片面積、較快的生長率及蒸騰作用，通常易于富集 Cd 等重金屬元素。煤礦區的稻米富集能力強弱順序為Cd﹥Zn﹥Cu﹥Pb﹥Cr﹥As，Cd富集能力最強，As最弱。稻米對于As的富集有明顯的特性，其根部對 As 的富集能力遠高于其他植物，但其根系砷含量與生育初期相比降低50%～90% ，由于鐵膜的緩沖層作用，稻米中As的含量很低[23]。

32結論

不同污染區土壤重金屬綜合污染指數均大于1，土壤污染嚴重;Cd的點位超標率達8085%，是特征污染元素。蔬菜重金屬富集系數表現為Cd﹥Zn﹥Cu﹥As﹥Cr﹥Pb，均小于1，典型污染區蔬菜重金屬的富集能力較弱，食物鏈風險較低。煤礦區稻米Cd、Cu、Zn超標倍數分別為67、11和15，THQ值均大于1，對人體具有潛在健康風險。

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