新疆阿克蘇地區部分豬場偽狂犬病病毒gE蛋白抗體ELISA檢測與分析

高佳敏 潘姣姣 魏鑫豪 桂成坤 孫世浩 張秋林 熱衣汗·玉素甫 李蓮瑞 石長青

（塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾843300）

偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起的一種在家畜之間流行的高度傳染性疫病，豬為該病的主要傳染源和宿主［1］。母豬以繁殖障礙為主要癥狀，如妊娠母豬流產、死胎等情況；仔豬則以發熱、腹瀉、呼吸困難、神經癥狀如共濟失調、肌肉震顫等為臨診特征［2］；患病公豬會出現睪丸腫脹、萎縮等癥狀，嚴重時會造成公豬不育，影響繁殖數量，為生豬養殖業帶來巨大的經濟損失［3］。

阿克蘇地區位于新疆維吾爾自治區中部，塔里木盆地北部，天山山脈中段南麓。生豬養殖業是阿克蘇地區畜牧業經濟發展的優勢產業之一，是阿克蘇地區畜牧業發展的一個重要方向［4］。本次血清學調查主要在2019 年1 月-11 月期間，采用間接酶聯免疫吸附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）的測定方法，檢測新疆阿克蘇地區6 個生豬標準化規模養殖場共計644 份血樣的PRV-gE 蛋白抗體情況，以期了解阿克蘇地區部分豬場偽狂犬病毒野毒的感染情況。

1 材料

1.1樣品來源

2019 年1 月-11 月期間，采集自新疆阿克蘇地區6 個規模化豬場644 份全血，將6 個生豬養殖場進行編號A-F。采集全血樣品為不同年齡階段的豬群，分別為經產母豬、種公豬、后備母豬、保育豬、仔豬。所采集血樣的6 個豬場均按照免疫程序免疫過gE 基因缺失疫苗，且未免疫過gE基因未缺失疫苗。

1.2試驗儀器和材料

豬偽狂犬病病毒gE（PRV gE）抗體ELISA 檢測試劑盒（北京金諾百泰生物技術有限公司）、自動酶標儀（美國BIO-RAD+iMarK）、采血器、離心機、微量移液器（Eppendorf）、計時器、震蕩儀、量筒、燒杯、錐形瓶等。

2 方法

2.1樣品采集

使用采血器無菌采集豬的前腔靜脈血3-5 mL/頭，待血清析出后，將血樣放置帶有冰袋的泡沫箱內帶回實驗室。將血樣放入離心機3 000 rpm/min 離心5 min，吸取上部淡黃色、透明清亮液體至無菌離心管，編號后立即檢測。

2.2 檢測方法

按照PRV-gE 抗體ELISA 檢測試劑盒說明書對離心好的新鮮血清進行PRV-gE蛋白抗體水平檢測。

首先，將1:1稀釋樣品、陰性對照血清（NC）、陽性對照血清（PC）加入抗原包被板相應孔中室溫（25±3 ℃）孵育1 h。然后，棄去孔中液體并進行洗滌；每孔加入100μl抗PRV gE HRP 標記抗體，室溫孵育20 min；孵育結束后棄去孔中的液體，再次進行洗滌。洗滌完成后向每孔加入100 μl 的TMB 底物液，在室溫條件下孵育15 min。再向每孔加入50 μl 的終止液，以終止酶促反應；最后，使用自動酶標儀在450 nm波長條件下測量吸光度值。

2.3 結果判定

（1）試驗成立條件：判定本試驗是否成立，需要滿足以下條件：①陰性對照的OD450nm平均值＞0.7；②陽性對照S/N 值＜0.3；③如果檢測結果不在界定范圍則需要重新進行檢測。（本實驗檢測結果中有兩份樣品檢測結果為可疑樣品，重復檢測后判定為陰性）

（2）NC OD值計算方法：NC OD值=（NC1+NC2）/2。

（3）樣品S/N值計算方法：S/N=樣品OD值/NC OD值。

3 結果

3.1不同規模化豬場PRV-gE 感染率分析

對阿克蘇地區不同規模豬場PRV-gE 感染情況進行統計分析，結果詳見表1。

表1 阿克蘇地區規模化豬場偽狂犬病毒gE抗體檢測結果

由表1 可知：被檢豬血清644 份，gE 蛋白抗體陽性13 份，陽性率為2. 02%。生豬養殖場A-F 中，B、D、E 共3 個場（養殖場）檢測出gE 抗體陽性血清，陽性率分別為4.26%、4.25%、6.38%。6個豬場的平均抗體陽性率為2. 48%。結果顯示，新疆阿克蘇地區部分豬場的PRV-gE蛋白抗體陽性率偏低，但PRV在阿克蘇地區仍存在。

3.2 不同年齡豬群PRV-gE 抗體陽性率分析

對阿克蘇地區部分規模化豬場不同年齡階段豬群進行PRV-gE感染情況進行分析，結果詳見表2。

表2 阿克蘇地區規模化豬場不同年齡階段豬偽狂犬病毒gE抗體檢測結果

由表2 可以看出：后備母豬、經產母豬、保育豬、種公豬、仔豬的PRV gE 抗體陽性率分別為1. 36%、2.61%、1.82%、1.52%、2.78%。結果顯示：所檢測豬群中，PRV gE 抗體陽性率最低的是后備母豬，最高的是仔豬。

4 討論

經調查，本試驗的6個規模化豬場采用的偽狂犬疫苗均為PRV-gE 基因的缺失疫苗。PRV 病毒屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）、ɑ-皰疹病毒亞科（Alpha herpesviridae），具有典型的皰疹病毒特征，PRV 的gE、TK、gG、gI 等毒力基因是其復制的非必須基因［5］；其中gE 蛋白具有最典型的膜蛋白特征，對PRV 侵襲神經、體內毒力表達和沿著神經傳遞都起著十分重要的作用［6］。幾乎所有的PRV 野毒株都可以表達gE糖蛋白，且gE缺失毒株與野生毒株相比，毒力大大降低，因此gE 基因在PRV 的野毒株鑒別診斷中具有重要意義［7］。本試驗采用豬偽狂犬病毒的gE 蛋白作為包被抗原的間接ELISA抗體檢測試劑盒，對新疆阿克蘇地區6 個生豬標準化規模養殖場共計644 份血樣的gE蛋白抗體情況進行了檢測與分析。

4. 1 阿克蘇地區不同規模化豬場PRV-gE 蛋白抗體水平

檢測結果表明：644份血清中，檢測出PRV-gE抗體陽性血清13 份，陽性率為2. 02%，低于2018 年魏其［8］報道的北疆地區PRV-gE 蛋白抗體陽性率45. 14%，低于2018 年馬博［9］報道的新疆巴州地區PRV-gE抗體陽性率9.48%，低于2013年宋剛華［10］報道的新疆庫車縣PRV-gE 抗體陽性率13. 70%，也低于2015 年高亮［11］報道的伊寧市gE 抗體陽性率19.31%。說明阿克蘇地區生豬養殖場的偽狂犬病免疫保護工作做得比較好。6個規模化豬場中有3個養殖場檢測出有gE 陽性抗體，平均gE 抗體陽性率為2.48%；不同豬場的感染率不同，說明各個豬場對豬偽狂犬病的防控程度不一，這可能與各豬場的地理位置、養殖密度、飼養管理水平和疫苗程序等多方面因素相關。

4. 2 阿克蘇地區規模化豬場不同類別豬群PRV-gE蛋白抗體水平

不同年齡階段的豬群豬偽狂犬病野毒感染情況存在差異，但差異情況并不明顯。調查結果表明：經產母豬和仔豬陽性率較高，分別為2.61%和2.78%；后備母豬和保育豬的陽性率稍低，分別為1. 36%和1.82%；種公豬的陽性率最低為1.52%；與2018 年馬博［9］報道的新疆巴州地區的結果相一致，與2017 年蘇玉賢［12］報道的河南地區平頂山市的結果也相一致。其中，經產母豬陽性率較高說明經產母豬經過多次免疫，抗體效價較高；但也極有可能是經產母豬帶毒普遍，只表現陰性感染，帶毒而不發病。若是陰性感染就需要加強經產母豬的豬偽狂犬病抗原水平檢測［13］。而仔豬陽性率較高可能是由染病母體傳染給胎兒，偽狂犬病病毒可通過胎盤垂直傳給胎兒，且被感染種豬和所生仔豬可長期帶毒。

通過試驗可以發現，阿克蘇地區預防PR 的免疫效果較好，但部分豬場仍有感染的情況，因而還需加強豬場飼養管理和疾病預防工作。