粉紅粘帚霉G-019淺盤發(fā)酵工藝研究

陳文虎　田玉虎　李鳳華

摘要? ? 為提高孢子產(chǎn)量，對粉紅粘帚霉G-019淺盤發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究，開展了固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)和營養(yǎng)液成分的篩選以及含量的單因素試驗。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵工藝為：固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)為麩皮75%、玉米粉15%、啤酒糟10%，營養(yǎng)液為糖蜜2%、磷酸氫二鉀0.15%、硫酸鎂0.05%，料液比1∶1。在此條件下發(fā)酵10 d，孢子數(shù)可達(dá)1.07×1010 CFU/g。

關(guān)鍵詞? ? 粉紅粘帚霉;淺盤發(fā)酵;篩選;工藝優(yōu)化

中圖分類號? ? TQ920.6? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）09-0092-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

Abstract? ? In order to improve the spore yield of Gliocladium roseum，the solid fermentation medium and nutrient solution were screened and the single factor experiment of the content were carried out.The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows：75% bran，15% corn meal，10% brewer′s grains，2% molasses，0.15% potassium hydrogen phosphate，0.5% magnesium sulfate，material liquid ratio 1∶1.Under these conditions，the number of spores could reach 1.07×1010 CFU/g in 10 days.

Key words? ? Gliocladium roseum;shallow plate fermentation;screen;technique optimization

粉紅粘帚霉（Gliocladium roseum），屬半知菌門絲孢綱叢梗孢目叢梗孢科粘帚霉屬[1]，是自然界一類重要的寄生菌，可寄生于植物和線蟲活體內(nèi)，也可作為腐生生物腐生長。粉紅粘帚霉近年來在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用得到了廣泛的開發(fā)，在植物線蟲病[2]、灰霉病[3-6]、玉米基腐病[7]、林果枝干病[8]、水稻紋枯病[9]和黃瓜枯萎病[10]等的生物防治上表現(xiàn)出巨大的開發(fā)潛力。

本研究為降低成本、提高產(chǎn)量，采用淺盤發(fā)酵法，對固態(tài)基料、營養(yǎng)液的成分和含量進(jìn)行了單因素篩選和優(yōu)化，以期篩選出最優(yōu)培養(yǎng)基配比，提高產(chǎn)孢量，為后續(xù)研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 供試材料

1.1.1? ? 供試菌種。粉紅粘帚霉G-019，為公司篩選、菌種庫保存的菌種。

1.1.2? ? 試劑。硫酸銨、硝酸鈉、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、氯化鈣等，均為分析純（AR）;蔗糖、葡萄糖、糖蜜、蛋白胨、酵母粉、瓊脂，均為生化試劑級（BR）;稻殼、麩皮、木薯渣、秸稈粉、麥粒、玉米粉、木薯粉、豆餅粉、花生餅粉、啤酒糟等，均符合試驗要求。

1.1.3? ? 儀器。電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、電加熱干燥箱、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、粉碎機。

1.1.4? ? 培養(yǎng)基。平板培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，液體菌種培養(yǎng)基為PDB培養(yǎng)基。

1.2? ? 試驗方法

1.2.1? ? 菌種保存與活化。將菌種庫甘油管菌種劃線接種于PDA平板培養(yǎng)基上，在28 ℃條件下培養(yǎng)7 d;使用時用接種環(huán)挑取一環(huán)孢子接種于液體PDB培養(yǎng)基中，搖床28 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min培養(yǎng)3 d。

1.2.2? ? 淺盤發(fā)酵。按照比例配制固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，并裝于長20 cm、寬10 cm、高5 cm的淺盤中，用8層紗布和1層牛皮紙封口，121 ℃滅菌20 min。待物料冷卻后，在超凈工作臺上去除紗布和牛皮紙，用滅菌的玻璃棒打散物料，接種液體菌種10%，并混合均勻，用滅菌的3層紗布封口，移至霉菌培養(yǎng)箱，于28 ℃、濕度70%條件下培養(yǎng)10 d。

1.2.3? ? 固態(tài)基質(zhì)篩選。分別以稻殼、麩皮、木薯渣、秸稈粉為固態(tài)基料進(jìn)行淺盤發(fā)酵試驗，篩選出最佳基質(zhì)后，以4∶1的比例分別與麥粒、玉米粉、木薯粉、豆餅粉、花生餅粉、啤酒糟混合發(fā)酵，并將篩選出的原料以0（CK）、5%、10%、15%、20%、25%的濃度梯度與基質(zhì)混合，篩選固態(tài)基質(zhì)最佳比例。每個處理3個平行。

1.2.4? ? 營養(yǎng)液篩選。在純化水中分別加入1%的葡萄糖、蔗糖、糖蜜作為速效碳源，加入1%的硫酸銨、尿素、硝酸鈉、蛋白胨、酵母粉作為速效氮源，并根據(jù)篩選結(jié)果分別以0（CK）、1%、2%、3%、4%、5%的濃度梯度進(jìn)行淺盤發(fā)酵，7 d后取樣計數(shù)，研究營養(yǎng)液中不同速效碳源和速效氮源對淺盤發(fā)酵的影響。分別在營養(yǎng)液中加入0.1%的磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、氯化鈣作為無機鹽，研究無機鹽對淺盤發(fā)酵的影響，并根據(jù)試驗結(jié)果，分別以0（CK）、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的濃度梯度研究無機鹽的最佳含量。

1.3? ? 孢子計數(shù)

孢子計數(shù)采用血球計數(shù)板計數(shù)法，取固態(tài)發(fā)酵樣品溶解、稀釋，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，并計算樣品的孢子數(shù)。每個樣品重復(fù)3次。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 固態(tài)基質(zhì)篩選

由圖1可知，不同固態(tài)發(fā)酵基料對粉紅粘帚霉G-019的淺盤發(fā)酵產(chǎn)孢量有顯著影響，固態(tài)基料為麩皮時最佳，孢子數(shù)可達(dá)1.23×109 CFU/g，其后依次是木薯渣、秸稈粉和稻殼。

由圖2可知，固態(tài)基質(zhì)中加入的營養(yǎng)物質(zhì)種類對粉紅粘帚霉G-019淺盤發(fā)酵產(chǎn)孢量影響顯著，加入玉米粉和啤酒糟時產(chǎn)孢量分別達(dá)到4.6×109 CFU/g和4.3×109 CFU/g。進(jìn)一步單因素梯度試驗表明，玉米粉含量為15%（圖3）、啤酒糟含量為10%（圖4）時，粉紅粘帚霉G-019淺盤發(fā)酵的產(chǎn)孢量最高。因此，粉紅粘帚霉G-019淺盤發(fā)酵的固態(tài)基質(zhì)最佳配比為麩皮75%、玉米粉15%、啤酒糟10%，此配比下粉紅粘帚霉G-019淺盤發(fā)酵產(chǎn)孢量可達(dá)到6.7×109 CFU/g。

2.2? ? 營養(yǎng)液篩選

由圖5可知，在培養(yǎng)液中加入不同種類的速效碳源，對粉紅粘帚霉G-019淺盤發(fā)酵產(chǎn)孢量均有明顯的提升作用，其中以加入糖蜜效果最佳。根據(jù)單因素試驗結(jié)果可知，營養(yǎng)液中加入2%糖蜜，淺盤發(fā)酵活菌數(shù)最高，可達(dá)8.5×109 CFU/g（圖6）。

研究表明，營養(yǎng)液中加入各種速效氮源對粉紅粘帚霉G-019淺盤發(fā)酵產(chǎn)孢量影響較小，這可能是因為固態(tài)基料中含有大量的啤酒糟（啤酒糟中含有大量的氮源，且在啤酒發(fā)酵過程中被分解為小分子量、可被快速吸收利用的氮源），因而不需額外添加速效氮源。

由圖8可知，營養(yǎng)液中加入磷酸氫二鉀和硫酸鎂對粉紅粘帚霉G-019淺盤發(fā)酵產(chǎn)孢量有明顯的提升作用。進(jìn)一步研究表明，磷酸氫二鉀的最佳含量為0.15%（圖9），硫酸鎂的最佳含量為0.05%（圖10），此配比下粉紅粘帚霉G-019淺盤發(fā)酵產(chǎn)孢量可達(dá)1.07×1010 CFU/g。

3? ? 結(jié)論與討論

在粉紅粘帚霉G-019淺盤發(fā)酵中，基質(zhì)種類和比例以及營養(yǎng)液中的速效碳源、無機鹽均對粉紅粘帚霉G-019產(chǎn)孢量有顯著影響。經(jīng)研究表明，固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)為麩皮75%、玉米粉15%、啤酒糟10%，營養(yǎng)液為糖蜜2%、磷酸氫二鉀0.15%、硫酸鎂 0.05%，料液比1∶1時是粉紅粘帚霉G-019淺盤發(fā)酵的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，淺盤發(fā)酵10 d最高孢子產(chǎn)量達(dá)到 1.07×1010 CFU/g。本研究可為后續(xù)的研究和工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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