核桃楸外果皮三萜類物質的提取及抑菌活性

郭映雪 孫墨瓏

摘 要：為探討核桃楸外果皮三萜類物質提取方法的響應面優化，研究其抑菌活性，本文采用超聲輔助的乙醇溶劑提取法提取核桃楸外果皮三萜類物質，并利用響應面法優化其提取工藝。在單因素實驗的基礎上，根據Box-Behnken中心組合法設計多因素試驗，分析乙醇體積分數、超聲時間和液料比對三萜類物質提取率的影響，確定最佳提取條件。此外，進一步研究三萜類物質對黃孢原毛平革菌（白腐真菌）和綠色木霉菌的抑菌活性。結果表明：核桃楸外果皮三萜類物質的最佳提取工藝條件為乙醇體積分數為80%、超聲時間為44 min、液料比為19∶1（mL/g），此時核桃楸外果皮三萜類物質的提取率為2.62 mg/g。抑菌實驗表明，核桃楸外果皮三萜類物質對黃孢原毛平革菌（白腐真菌）和綠色木霉菌均具有抑菌效果，最大抑菌圈直徑分別達到18.43 mm和18.92 mm。本研究表明核桃楸外果皮三萜類提取物具有良好的抑菌活性，為核桃楸外果皮的開發和研究提供參考。

關鍵詞：核桃楸;三萜類物質;超聲提取;響應面;抑菌活性

Abstract：To optimize the extraction method of triterpenoids from the green peel of Juglans mandshurica Maxim by response surface， and to study its antibacterial activity， ultrasound-assisted ethanol extraction was used to extract the triterpenoids from the green peel of Juglans mandshurica， and the extraction process was optimized by response surface methodology （RSM）. On the basis of single factor experiment， the optimal extraction conditions were explored through Box-Behnken central composite design， studying the effects of ethanol volume fraction， ultrasonic time and liquid-to-material ratio on the extraction rate of triterpenoids. In addition， the antibacterial activities of triterpenoids against Phanerochaete chrysosporium Burdsall and Trichoderma viride were further studied. The results showed that the optimal extraction conditions of triterpenoids from the green peel of Juglans mandshurica were： ethanol volume fraction 80%， ultrasonic time 44 min， liquid to material ratio 19∶1， and extraction rate was 2.62 mg/g. The bacteriostasis test showed that the triterpenoids of the green peel of Juglans mandshurica had antibacterial activities against Phanerochaete chrysosporium Burdsall and Trichoderma viride， the maximum inhibition zone diameter was 18.43 mm and 18.92 mm respectively. This study showed triterpenoids in the green peel of Juglans mandshurica had good bacteriostatic activity and provided a reference for the development and research of the green peel of Juglans mandshurica.

Keywords：Juglans mandshurica Maxim; triterpenoid; ultrasonic extraction; response surface; antibacterial activity

0 引言

核桃楸（Juglans mandshurica Maxim）是胡桃科、胡桃屬植物，落葉喬木，主要分布于我國東北、華北和河北等地區，是東北三大硬闊樹種之一，是一種前景廣闊的木本油料植物。核桃楸是我國十分重要的藥源植物，其樹皮、樹葉及成熟的果實與果皮均可入藥，均有顯著的抗菌、消炎、抗氧化以及抗癌等作用[1-3]。近年來研究發現，核桃楸的不同部位均具有一定的藥用價值，核桃楸外果皮的主要化學成分包括黃酮類、鞣質類、生物堿、萜類及強心苷等活性物質[4-7]。萜類是三大次生代謝產物之一，在自然界分布廣泛，尤其存在中國的傳統天然藥物中，具有廣泛的藥理作用和重要的生物活性[8-10]。萜類物質是指具有（C5H8）n通式以及其含氧和不同飽和程度的衍生物，可以看成是由異戊二烯或異戊烷以各種方式連結而成的一類天然化合物，可分為單萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜及多萜化合物等[11]。其中三萜類化合物作為一類重要的天然化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調節、調節血糖、降血壓和抗腫瘤等作用[12]。相關人員對核桃楸的研究主要集中對黃酮類、醌類、酚類、揮發油和多糖類等化學成分及其生物活性的研究，有關核桃楸外果皮的三萜類物質提取和應用尚鮮有報道。本實驗以熊果酸為標準品，采用超聲輔助的乙醇溶劑提取法提取核桃楸外果皮三萜類物質，運用響應面法對其提取工藝進行優化，并探討核桃楸外果皮三萜類物質對黃孢原毛平革菌（白腐真菌）和綠色木霉菌的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

材料：核桃楸外果皮，采于2017年東北林業大學實驗林場;黃孢原毛平革菌（白腐真菌）（Phanerochaete chrysosporium）和綠色木霉菌（Trichoderma viride）均由東北林業大學工程技術學院實驗室提供。試劑：熊果酸標準品，優級純（阿拉丁試劑）;乙醇、冰乙酸、香草醛和高氯酸均為分析純。儀器：RE-2000 A旋轉蒸發儀，KQ 3200 DE型數控超聲波清洗器，TU-1901型紫外分光光度計，800型電動離心機，BS-224-S電子天平，DHG 9145 A電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.2 實驗方法

稱量5 g核桃楸外果皮粗粉，溶于乙醇溶液里超聲提取，抽濾離心后得到乙醇粗提溶液。將其減壓旋轉蒸發后，加入水、氯仿和甲醇各100 mL，體積比為1∶1∶1，進行萃取，分離留下氯仿液。將其減壓旋轉蒸發后，加入50 mL無水甲醇溶液，得到三萜類物質提取液。

1.2.1 單因素法探究提取條件

采用單因素法，分別探究乙醇體積分數、超聲時間和液料比對三萜類物質提取率的影響，得到各因素最佳提取條件?？刂瞥晻r間40 min和液料比15∶1不變，比較不同乙醇體積分數50%、60%、70%、80%、90%條件下三萜類物質的提取率;控制乙醇體積分數80%和液料比15∶1不變，比較不同超聲時間20、30、40、50、60 min下三萜類物質的提取率;控制乙醇體積分數80%和超聲時間40 min不變，比較不同液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1條件下三萜類物質的提取率[13]。

1.2.2 響應面優化試驗

在單因素實驗的基礎上，運用Design-Expert軟件，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理選取影響三萜類物質提取的3個因素：乙醇體積分數、超聲時間和液料比進行響應面優化組合[14]，表1為因素水平設計表。

1.3 測定方法

1.3.1 熊果酸標準溶液曲線的繪制

精密稱取10 mg熊果酸標準樣品，溶于無水甲醇中，定容至50 mL，搖勻制成濃度為0.2 mg/mL的熊果酸標準品溶液。吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL熊果酸標準品溶液分別置于試管中，水浴蒸干，滴加0.4 mL的5 %香草醛醋酸溶液和1.6 mL高氯酸溶液，在65 ℃水浴加熱15 min，取出冷凝水沖涼至室溫，加5 mL冰醋酸搖勻后靜置，在最大吸收峰548 nm處測定吸光度[13]，繪制標準曲線得到回歸方程為：

A = 36.573c + 0.378。

式中：A為吸光度;c為標準品熊果酸的濃度，mg/mL。決定系數R2 = 0.999。

1.3.2 三萜類物質的含量測定

精確抽取1 mL甲醇溶液于試管中，進行上述標準品的定性鑒定，在最大吸收峰548 nm處測定吸光度A，將其代入標準曲線回歸方程中，即可得到三萜類物質含量。

1.3.3 三萜類物質的抑菌實驗

將已高溫滅菌的PDA培養基倒入培養皿中冷卻凝固，用接種針取適量白腐真菌或綠色木霉菌放入盛有玻璃珠和蒸餾水的試管中，劇烈震蕩試管打散菌絲。取棉簽輕輕蘸取試管中的白腐真菌或綠色木霉菌菌液10～20次均勻涂在培養基上，待用。將核桃楸外果皮三萜類提取原液用無水甲醇稀釋至濃度分別為44、22、11、5.5 μg/mL的一系列三萜類提取液，及空白對照樣無水甲醇。用打孔器依次在培養基上打出5個孔，將溶液按照濃度打入孔中，平行3次。置于恒溫恒濕培養箱中培養，每天觀察生長情況，通過十字交叉法用游標卡尺測量孔內徑，記錄抑菌圈直徑，比較抑菌作用的大小，計算抑菌效率[15-16]。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

單因素實驗結果如圖1所示。由圖1（a）可以看出，三萜類物質提取率隨乙醇體積分數的增大呈現先上升后下降的趨勢，當乙醇體積分數達到80%時，提取率達到最大值。此時繼續增加乙醇體積分數，提取率反而下降，因為乙醇體積分數過高，溶劑的極性降低，一些醇溶性雜質和極性比較小的成分溶出，阻礙目標活性成分的溶出，導致提取率下降。

由圖1（b）可以看出，三萜類物質提取率隨超聲時間的延長呈現出先上升后下降的趨勢，當超聲時間為40 min時，提取率達到最大值。原因是延長超聲時間，提取液的溫度上升，使三萜類物質的溶出量增多;但當超聲時間過長，提取液的溫度過高，導致部分三萜類物質被分解，結構被破壞，從而使提取率下降。

由圖1（c）可以看出，三萜類物質提取率隨料液比的增大呈現先上升后緩慢下降的趨勢，當液料比為15∶1時，提取率達到最大值。主要是由于提取溶劑用量的增加提高了核桃楸外果皮原料與溶劑間三萜類物質的濃度差，有利于其從原料向溶劑中擴散，提高提取率;當大部分活性物質已經滲出時，再增加液料比，提取率反而下降，可能是需要蒸發濃縮的時間更久，三萜類物質結構被破壞，考慮成本，選擇15∶1 mL/g[17]。

2.2 響應面結果分析與優化

2.2.1 響應面優化設計模型的建立

在單因素實驗結果的基礎上，對提取核桃楸外果皮三萜類物質進行三因素三水平響應面優化組合，表2為優化響應面方案設計及試驗結果。

2.2.2 回歸方程與方差分析

通過Design Expert對結果數據進行多項回歸擬合分析，建立提取率（Y）與乙醇體積分數（A）、超聲時間（B）、液料比（C）的線性回歸方程：

回歸模型的方差分析顯示，P<0.000 1，說明該模型具有顯著性，且差異極顯著（P<0.01）。決定系數R2=0.975 7，修訂系數R2Adj=0.944 5，說明該模型擬合度較好，試驗誤差小[18]。信噪比為13.895>4，說明該模型響應信號強，回歸方程擬合度好，可進行真實值的分析和預測試驗結果。變異系數（C.V）=8.23，說明該模型可重復。一次項C和二次項A2、B2、C2對三萜類物質提取率的影響是極顯著的;一次項A、B對三萜類物質提取率的影響是顯著的;交互項AC交互影響存在顯著關系，其他交互影響均不存在顯著性差異。三因素對三萜類物質提取率的影響大小順序為：液料比（C）、乙醇體積分數（A）、超聲時間（B）。

2.2.3 等值線圖和響應面圖分析

利用Design Expert對結果數據進行分析，乙醇體積分數、超聲時間和液料比選取一個因素固定，其他兩因素及其交互作用對三萜類物質提取率的等值線圖和響應面圖如圖2所示。

模型中A、B、C，其中兩個因素固定在0水平，得到另外一個因素對三萜類物質提取率的子模型。由圖2可以看出，乙醇體積分數（A）和超聲時間（B）、乙醇體積分數（A）和液料比（C）、超聲時間（B）和液料比（C）對三萜類提取率的交互作用。響應面坡陡峭程度和等高線形狀反映出交互作用的強度，如果響應面坡度相對平緩，則說明受提取因素變化的影響不大;相反，如果坡度比較陡峭，則說明響應面值受提取因素變化的影響較大。若等高線呈橢圓形，表明兩兩因素相互效應明顯，呈圓形則反之[19]。圖2中3個響應面圖均為平滑的曲面，且開口向下，說明最大響應值就存在于曲面上，且在所設計的因素水平范圍內能夠找到最佳工藝條件。

由Design Expert軟件進一步對工藝參數進行最優化分析，得到提取的最佳工藝參數為：乙醇體積分數為82.48%、超聲時間為44.45 min、液料比為19.42∶1 mL/g，預測值為2.67 mg/g?？紤]到試驗的可操作性，將修正為：乙醇體積分數為80%、超聲時間為44 min、液料比為19∶1 mL/g，重復三次驗證試驗。按上述修正后的條件進行提取，得到三萜類物質的平均提取率為2.62 mg/g，與預測值的相對誤差為1.87%，說明模型可靠，提取效果理想。王占一等[13]從石榴皮中超聲波輔助提取三萜類化合物，并通過響應面試驗優化工藝條件，提取率大大提升為0.563%。本實驗采用超聲輔助的乙醇溶劑提取法提取核桃楸外果皮三萜類物質，在單因素實驗確定每個影響因素的最佳值后，利用響應面法進一步優化其提取工藝條件，提取結果與響應面模型預測值相差不大，驗證了提取工藝可行。

2.3 三萜類物質抑菌效果分析

用外果皮三萜類物質提取液處理后，觀察到白腐真菌和綠色木霉菌均從第4天開始生長（圖3），其中1、2、3、4分別代表濃度為44、22、11、5.5 μg/mL的三萜類提取液，5代表空白對照。之后每天測量產生抑菌圈直徑的大小，其直徑變化情況如圖4和圖5所示。

核桃楸外果皮三萜類物質提取液的抑菌活性實驗證明，其對白腐真菌和綠色木霉菌均有較明顯的抑菌活性。由圖4可知，在白腐真菌生長的4～9 d中，

同理，由圖5可知，只有5.5 μg/mL的三萜類物質提取液幾乎和空白對照樣的抑菌圈直徑相同，其他濃度提取液的抑菌性遠比空白樣強，并且抑菌效果與提取液濃度有關。在試驗的濃度范圍內，抑菌性與萜類提取物濃度呈正相關。其中44 μg/mL的三萜類物質提取液最大抑菌圈直徑為18.92 mm，最小抑菌圈直徑為12.61 mm，間隔時間為5 d，其抑菌效率為1.26 mm/d。

三萜類物質具有較強的抑菌性。劉高強等[20]檢測出赤芝菌體三萜化合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長均具有顯著抑制作用。本實驗中三萜類物質提取液對白腐真菌和綠色木霉菌產生的抑菌圈直徑隨著時間先下降后趨于穩定，其中在前3 d下降最快，抑菌效果最佳。可能是由于培養的菌種進入了對數生長期，生長速率較快，抑菌圈直徑變化較大[21]。推測三萜類物質具有抑菌性的原因為其可以破壞菌種結構，擾亂菌種生長周期，抑制目標菌細胞內的糖類及代謝中間產物的氧化脫氫過程，同時降低細胞內酶的活性，甚至是直接抑制細胞內核酸分子合成，從而達到使細胞凋亡，進而達到殺滅細菌的目的[22]。三萜類物質提取液對白腐真菌和綠色木霉菌的抑菌效果與提取液濃度成正比，濃度越大，抑菌效果越好，具有較好的抑菌活性。由此可見，核桃楸外果皮具有良好的生物活性，可以進一步開發其更多的綜合利用價值。

3 結論

在單因素實驗的基礎上，采用超聲輔助的乙醇溶劑提取法提取核桃楸外果皮三萜類物質，利用響應面法在三因素三水平的設計下，優化提取工藝條件，得到各因素的主要影響關系由大到小順序為：液料比、乙醇體積分數、超聲時間。最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數為80%、超聲時間為44 min、液料比為19∶1，最大提取率可達到2.62 mg/g。與響應面預測值2.67 mg/g的相對誤差為1.87%，說明模型可靠，提取效果理想。核桃楸外果皮三萜類物質對黃孢原毛平革菌（白腐真菌）和綠色木霉菌均具有一定的抑菌效果，最大抑菌圈直徑分別達到18.43 mm和18.92 mm，但受提取液濃度影響較大，提取液濃度越小，抑菌效果越不明顯。

我國核桃楸資源豐富，關于三萜類活性物質的研究報道較少。本文說明核桃楸外果皮三萜類物質的提取工藝切實可行，并具有一定的抑菌作用，為其進一步開發利用提供參考。

【參 考 文 獻】

[1] 沈廣志， 鄒桂華， 梁婷，等.核桃楸的化學成分研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21（17）：219-224.

SHEN G Z， ZOU G H， LIANG T， et al. Chemical constituents of Juglans mandshurica[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae， 2015， 21（17）： 219-224.

[2]XU H L， YU X F， QU S C， et al. Anti-proliferative effect of Juglone from Juglans mandshurica Maxim on human leukemia cell HL-60 by inducing apoptosis through the mitochondria-dependent pathway[J]. European Journal of Pharmacology， 2010， 645（1/2/3）： 14-22.

[3]LIU L J， LI W， SASAKI T， et al. Juglanone， a novel α-tetralonyl derivative with potent antioxidant activity from Juglans mandshurica[J]. Journal of Natural Medicines， 2010， 64（4）： 496-499.

[4]彭小進，王天淼，孫墨瓏.核桃楸葉多酚提取工藝的響應面法優化及其抗氧化性分析[J].福建農業學報，2017，32（7）：746-750.

PENG X J， WANG T M， SUN M L. Process optimization and antioxidant activity of polyphenols extracted from leaves of Juglans mandshurica Maxim[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences， 2017， 32（7）： 746-750.

[5]LIN H， ZHANG Y W， HUA Y， et al. Three new compounds from the stem bark of Juglans mandshurica[J]. Journal of Asian Natural Products Research， 2014， 16（8）： 819-824.

[6]劉暢，周曉棉，孫非非，等.胡桃楸提取物的抗腫瘤作用[J].沈陽藥科大學學報，2013，30（10）：799-802.

LIU C， ZHOU X M， SUN F F， et al. Investigation into the anti-tumor activity of Juglans mandshurica Maxim. extracts[J]. Journal of Shenyang Pharmaceutical University， 2013， 30（10）： 799-802.

[7]陳苛蒙，金黎明，包艷春，等.核桃楸皮提（萃）取物的抑菌性能研究[J].大連民族大學學報，2018，20（3）：205-209.

CHEN K M， JIN L M， BAO Y C， et al. Research on antibacterial activity of bark extractive of Juglans mandshurica Maxim[J]. Journal of Dalian Minzu University， 2018， 20（3）： 205-209.

[8]劉蒲，王國權.五環三萜類化合物的藥理作用研究進展[J].海峽藥學，2018，30（10）：1-4.

LIU P， WANG G Q. Advances on pharmacological action of pentacyclic triterpenoids[J]. Strait Pharmaceutical Journal， 2018， 30（10）： 1-4.

[9]李娜，李鑫，祝子坪，等.舟山新木姜子揮發性成分的季節性變化及抑菌、抗氧化效果研究[J].林業科技，2018，43（5）：12-15.

LI N， LI X， ZHU Z P， et al. Component analysis， antibacterial， antioxidant effect of essential oil from Neolitsea sericea[J]. Forestry Science & Technology， 2018， 43（5）：12-15.

[10]SUN M L， WANG Y M， SONG Z Q， et al. Insecticidal activities and active components of the alcohol extract from green peel of Juglans mandshurica[J]. Journal of Forestry Research， 2007， 18（1）： 62-64.

[11]尹衛平.天然產物化學化工[M].北京：化學工業出版社，2015.

YIN W P. Natural products chemistry and chemical industry[M]. Beijing： Chemical Industry Press， 2015.

[12]SHANMUGAM M K， NGUYEN A H， KUMAR A P， et al. Targeted inhibition of tumor proliferation， survival， and metastasis by pentacyclic triterpenoids： Potential role in prevention and therapy of cancer[J]. Cancer Letters， 2012， 320（2）： 158-170.

[13]王占一，鄭丹丹，王京龍，等.響應面試驗優化超聲波輔助提取石榴皮中三萜類化合物工藝及動力學分析[J].食品科學，2015，36（22）：11-17.

WANG Z Y， ZHENG D D， WANG J L， et al. Optimization and kinetic analysis of ultrasonic-assisted extraction of triterpenoids from pomegranate rind[J]. Food Science， 2015， 36（22）： 11-17.

[14]吳冕，孫墨瓏.核桃楸外果皮總蒽醌的提取及抗氧化性研究[J].森林工程，2019，35（3）：48-53.

WU M， SUN M L. Extraction of total anthraquinones from green peel of Juglans mandshurica Maxim and its antioxidant activity[J]. Forest Engineering， 2019， 35（3）： 48-53.

[15]常璐璐，孫墨瓏，徐國祺，等.樟樹葉提取物對木材霉菌的防治效果及防霉機理研究[J].北京林業大學學報，2017，39（1）：99-106.

CHANG L L， SUN M L， XU G Q， et al. Control efficiency and action mechanisms of camphor leaf extractives on mold resistance of wood[J]. Journal of Beijing Forestry University， 2017， 39（1）： 99-106.

[16]RAMN-SIERRA J， PERAZA-LPEZ E， RODRGUEZ-BORGES R， et al. Partial characterization of ethanolic extract of Melipona beecheii Propolis and in vitro evaluation of its antifungal activity[J]. Revista Brasileira De Farmacognosia， 2019， 29（3）： 319-324.

[17]呂丹，唐克慧，王宇弛，等.同步提取山楂皮中總多酚、總黃酮和三萜類物質的工藝優化[J].河南工業大學學報（自然科學版），2018，39（5）：69-75.

LV D， TANG K H， WANG Y C， et al. Optimization of the synchronous extraction process of total polyphenols， total flavonoids and triterpenoids from hawthorn peels[J]. Journal of Henan University of Technology （Natural Science Edition）， 2018， 39（5）： 69-75.

[18]ANWAR K， SAID M， AFIZAL M， et al. Overview on the response surface methodology （RSM） in extraction processes[J]. Journal of Applied Science & Process Engineering， 2015， 2（1）： 8-17.

[19]李莉，張賽，何強，等.響應面法在試驗設計與優化中的應用[J].實驗室研究與探索，2015，34（8）：41-45.

LI L， ZHANG S， HE Q， et al. Application of response surface methodology in experiment design and optimization[J]. Research and Exploration in Laboratory， 2015， 34（8）： 41-45.

[20]劉高強，章春蓮，彭廣生.赤芝菌體中三萜抑菌作用研究[J].時珍國醫國藥，2008，19（11）：2578-2579.

LIU G Q， ZHANG C L， PENG G S. Invitro bacteriostasis of triterpenoids from Mycelium of Ganodermalucidum[J]. Lishenzhen Medicine and Materia Medicare Search， 2008， 19（11）： 2578-2579.

[21]TIAN J， BAN X Q， ZENG H， et al. The mechanism of antifungal action of essential oil from dill （Anethum graveolens L.） on Aspergillus flavus[J]. PLoS One， 2012， 7（1）： e30147.

[22]李元政，胡文忠，薩仁高娃，等.天然植物提取物的抑菌機理及其在果蔬保鮮中的應用[J].食品與發酵工業，2019，45（14）：239-244.

LI Y Z， HU W Z， SA R G W， et al. Antimicrobial mechanisms of natural plant extracts and applications in preserving fruits and vegetables[J]. Food and Fermentation Industries， 2019， 45（14）： 239-244.