復(fù)方芪苓配方顆粒對(duì)尿酸性腎病模型大鼠作用機(jī)制研究

張 媛 徐 紅

隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，原發(fā)性高尿酸血癥的發(fā)病率不斷升高，且發(fā)病年齡逐漸低齡化[1-2]。高尿酸血癥是尿酸性腎病的生化基礎(chǔ)，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，高尿酸血癥人群的慢性腎臟病發(fā)病率明顯高于血尿酸正常人群[3]。目前西藥治療尿酸性腎病雖有確切的療效，但同時(shí)也存在著較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)，部分藥物有一定程度的腎損害風(fēng)險(xiǎn)，使用的安全范圍小[4]。近年來(lái)中醫(yī)藥治療尿酸性腎病已取得顯著療效，中藥不但能控制病情進(jìn)展，且具有副作用小、增效減毒的優(yōu)勢(shì)。復(fù)方芪苓配方顆粒由黃芪、土茯苓等組方而成，具有健脾益腎、化瘀泄?jié)岬墓δ堋１菊n題組前期已初步證實(shí)其具有降低血清尿酸的作用[5]。本文基于前期工作，重點(diǎn)研究其對(duì)尿酸性腎病大鼠腎功能水平、肝臟黃嘌呤氧化酶活性，以及腎臟尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體方面的影響，為臨床治療尿酸性腎病提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的健康清潔級(jí)SD 雄性大鼠60 只[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK（滬）2013-0016，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):2008001654872]，8 周齡，體質(zhì)量±150g，飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水。通風(fēng)條件由自動(dòng)換氣系統(tǒng)進(jìn)行，通風(fēng)頻率8～15 次/h，燈光照明12h/天，溫度22～26℃，濕度50%～60%[動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用許可證號(hào):SYXK（浙）2013-0184]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批（動(dòng)物管理及福利倫理審查決議書號(hào):ZSLL-2015-141）。

1.2 主要試劑 尿酸、肌酐、尿素測(cè)定試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)160651、160322、160617）；黃嘌呤氧化酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20170322）；一抗購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司，兔抗大鼠URAT1 多克隆抗體（批號(hào)bs-0605R）；兔抗大鼠OAT1 多克隆抗體（批號(hào)bs-0600R）；兔抗大鼠OCT2 多克隆抗體（批號(hào)bs-1066R）；二抗購(gòu)自杭州嘉朗生物技術(shù)有限公司（批號(hào)GC600705）；腺嘌呤（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)73-26-5，用滅菌注射用水配成濃度為4mg/mL 混懸液）；氧嗪酸鉀（日本TCI 公司，批號(hào)2209-75-3，規(guī)格:BR，98%，用滅菌注射用水配成濃度為25mg/mL 注射液）；別嘌醇片（上海信誼萬(wàn)象藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)H31020334，規(guī)格:100mg/片，用滅菌注射用水配成濃度為0.525mg/mL 混懸液）。

1.3 復(fù)方芪苓配方顆粒配制 山慈菇6g，桑寄生15g，土茯苓、薏苡仁各30g，秦艽12g，丹參、黃芪各15g，所需中藥飲片均購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，并由杭州市中醫(yī)院制劑室制成顆粒劑后分別配成含生藥量0.12、0.24、0.48g/mL 的溶液，低溫保存?zhèn)溆肹6]。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分成正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、復(fù)方芪苓配方顆粒高、中、低劑量組及別嘌醇組，每組10 只。正常對(duì)照組給予普通飼料，并每天給予25mL/kg 蒸餾水灌胃、4mL/kg 無(wú)菌注射用水腹部皮下注射，其余5組以10%的酵母粉飼料飼喂，并每天給予0.1g/kg 腺嘌呤灌胃、0.1g/kg 氧嗪酸鉀鹽腹部皮下注射，連續(xù)造模2 周。實(shí)驗(yàn)第14 天禁食8h 后在模型對(duì)照組中隨機(jī)取2 只大鼠處死取腎臟組織，進(jìn)行HE 染色，觀察腎臟組織病理提示有尿酸鹽結(jié)晶沉著于腎小管和腎間質(zhì)，提示造模成功。各組大鼠在造模后同時(shí)分別每天灌胃給藥，其中復(fù)方芪苓配方顆粒高劑量組為9.6g/kg、中劑量組為4.8g/kg、低劑量組為2.4g/kg；別嘌醇組10.5mg/kg（相當(dāng)于60kg 體質(zhì)量成人100mg/天）；正常對(duì)照組及模型對(duì)照組給予蒸餾水20mL/kg 灌胃，連續(xù)給藥2 周。

2.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥次日稱重后腹腔注射戊二醛麻醉，從大鼠腹主動(dòng)脈采血，低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Heraeus，Biofuge Stratos） 以離心半徑8cm，10000r/min 離心5min，取血清在全自動(dòng)生化分析儀（日本Olympus，AU2700）上按照試劑盒說(shuō)明書分別采用肌氨酸氧化酶法、尿素酶法、尿酸酶法測(cè)定各組大鼠血清肌酐、尿素、尿酸含量。然后斷頸處死大鼠，在冰臺(tái)上快速分取肝臟，稱重后迅速與預(yù)冷的生理鹽水1:9 混合，研磨勻漿后低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Sorvall，Leged RT）以離心半徑14cm，8000r/min 離心10min，取上清液在分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠，721-100）上用化學(xué)比色法按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)黃嘌呤氧化酶活性。

2.3 免疫組化法檢測(cè)腎臟組織OAT1、OCT2、URAT1的表達(dá) 同時(shí)在冰臺(tái)上分取腎臟組織，稱重后置于10%的甲醛溶液中固定24h，常規(guī)石蠟包埋切片，然后將腎臟組織的石蠟切片脫蠟水化，經(jīng)高壓修復(fù)抗原后加兔抗大鼠OAT1、OCT2、URAT1 多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，按二抗法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明孵育二抗，DBA 顯色，蘇木素復(fù)染。各組標(biāo)本顯微鏡下采集5 個(gè)不重復(fù)的視野，通過(guò)Image Pro-Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化染色結(jié)果分析，分別統(tǒng)計(jì)所選視野陽(yáng)性反應(yīng)的光密度值，取其平均值作為各組切片的平均光密度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較方差齊者用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊者用Games-Howell 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 復(fù)方芪苓配方顆粒對(duì)尿酸性腎病模型大鼠血清肌酐、尿素、尿酸的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清肌酐、尿素、尿酸水平顯著升高（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，別嘌醇組及復(fù)方芪苓配方顆粒各劑量組血清肌酐、尿酸均明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）；復(fù)方芪苓配方顆粒高、中劑量組血清尿素均顯著降低（P＜0.01）。與別嘌醇組比較，復(fù)方芪苓配方顆粒高、中劑量組血清肌酐和尿素都有顯著降低（P＜0.01），中、低劑量組血清尿酸顯著高于別嘌醇組（P＜0.01），高劑量組血清尿酸無(wú)顯著性差異（P＞0.05），見表1。

3.2 復(fù)方芪苓配方顆粒對(duì)尿酸性腎病模型大鼠肝臟黃嘌呤氧化酶的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組黃嘌呤氧化酶活性顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，別嘌醇組黃嘌呤氧化酶活性顯著降低（P＜0.01），復(fù)方芪苓配方顆粒高、中劑量組黃嘌呤氧化酶活性也有明顯降低（P＜0.05），低劑量組黃嘌呤氧化酶活性有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。別嘌醇組黃嘌呤氧化酶活性顯著低于復(fù)方芪苓配方顆粒各組（P＜0.01）。見表2。

3.3 復(fù)方芪苓配方顆粒對(duì)尿酸性腎病模型大鼠腎臟OAT1、OCT2、URAT1 蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠腎臟組織OAT1、OCT2 表達(dá)均下調(diào)，同時(shí)URAT1 表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，別嘌醇組和復(fù)方芪苓配方顆粒高劑量組OAT1 的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），別嘌醇組和復(fù)方芪苓配方顆粒高、中劑量組OCT2 的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；復(fù)方芪苓配方顆粒高、中劑量組的大鼠腎臟URAT1 的表達(dá)較模型對(duì)照組顯著下調(diào)（P＜0.01），明顯優(yōu)于別嘌醇組（P＜0.01），見表3。

表1 復(fù)方芪苓配方顆粒對(duì)尿酸性腎病模型大鼠血清肌酐、尿素、尿酸的影響（μmol/L，）

表1 復(fù)方芪苓配方顆粒對(duì)尿酸性腎病模型大鼠血清肌酐、尿素、尿酸的影響（μmol/L，）

注:正常對(duì)照組、模型對(duì)照組予蒸餾水20mL/kg 灌胃；別嘌醇組予別嘌醇10.5mg/kg 灌胃；復(fù)方芪苓配方顆粒高、中、低劑量組分別按9.6、4.8、2.4g/kg 灌胃；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型對(duì)照組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與別嘌醇組比較，cP＜0.01

表2 復(fù)方芪苓配方顆粒對(duì)尿酸性腎病大鼠模型肝臟黃嘌呤氧化酶的影響（）

表2 復(fù)方芪苓配方顆粒對(duì)尿酸性腎病大鼠模型肝臟黃嘌呤氧化酶的影響（）

注:正常對(duì)照組、模型對(duì)照組予蒸餾水20mL/kg 灌胃；別嘌醇組予別嘌醇10.5mg/kg 灌胃；復(fù)方芪苓配方顆粒高、中、低劑量組分別按9.6、4.8、2.4g/kg 灌胃；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型對(duì)照組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與別嘌醇組比較，cP＜0.01

4 討論

尿酸性腎病是血尿酸生成過(guò)多或排泄減少導(dǎo)致血中尿酸鹽呈過(guò)飽和狀態(tài)，尿酸鹽結(jié)晶沉積于腎臟而引起的腎臟損害，又稱為痛風(fēng)性腎病、高尿酸性腎病，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為腎衰竭。歐洲透析移植協(xié)會(huì)資料顯示尿酸性腎病占終末期腎衰竭患者的0.6%～1.0%[7]。中醫(yī)對(duì)于尿酸性腎病的診斷和命名無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)患者臨床特征，歸屬中醫(yī)“痹證”“痛風(fēng)”“歷節(jié)病”“淋證”“溺毒”等范疇。究其病因病機(jī)為先天脾腎虛損，氣化失司，升降失職，清濁不分，體內(nèi)代謝廢物蓄積，釀生濕、濁、痰、瘀為患；又或后天飲食不節(jié)，過(guò)食肥甘厚味，日久傷脾，脾失健運(yùn)，腎失蒸騰，氣化失司，痰濕內(nèi)生，出現(xiàn)濕瘀蘊(yùn)阻之證，日久不愈，流于下焦，病損及腎，濁毒內(nèi)停，發(fā)為該病。《類證治裁·痹癥》對(duì)于痹癥日久不愈提到“必有濕痰敗血瘀滯經(jīng)絡(luò)”，故痰濁瘀滯脈中是引起尿酸性腎病的重要因素。該病屬本虛標(biāo)實(shí)之證，治療當(dāng)宜健脾益腎、化瘀泄?jié)帷⑶鍩崂麧瘢瑯?biāo)本兼顧。復(fù)方芪苓配方顆粒在我院應(yīng)用多年療效良好，方中土茯苓解毒除濕，通利關(guān)節(jié)，有明顯的降尿酸作用；黃芪健脾補(bǔ)中，升陽(yáng)舉陷，益衛(wèi)固表，利尿[8]。山慈菇清熱解毒、消癰散結(jié)，其所含秋水仙堿對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有治療作用；秦艽清熱祛風(fēng)通絡(luò)，有促進(jìn)尿酸排泄作用；薏苡仁健脾利濕、除痹清熱；丹參可活血化瘀通絡(luò)、促進(jìn)組織修復(fù)和再生；桑寄生既有滋補(bǔ)脾腎作用，又有利濕降濁化痰之功，補(bǔ)中有通，寓通于補(bǔ)，防上述祛濕化瘀藥攻伐太過(guò)；諸藥相伍，集健脾益腎，利濕通絡(luò)化瘀于一身，使?jié)岫镜靡孕够痆9-11]。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于高尿酸血癥、尿酸性腎病的研究主要有通過(guò)抑制肝臟黃嘌呤氧化酶的活性減少尿酸生成，及通過(guò)調(diào)控腎臟尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體增加尿酸排泄兩方面[12]。尿酸合成依賴于相關(guān)的酶，而黃嘌呤氧化酶是其中重要的酶之一，直接調(diào)控體內(nèi)尿酸水平的高低。別嘌醇作為黃嘌呤氧化酶抑制劑，目前仍是臨床高尿酸血癥治療的一線藥物，但存在較多嚴(yán)重的不良反應(yīng)。近年來(lái)研制的非布司他也屬于黃嘌呤氧化酶抑制劑，療效優(yōu)于別嘌醇，但不建議應(yīng)用于尿酸鹽較高的患者，且非布司他對(duì)于嚴(yán)重腎功能不全患者的安全性尚未進(jìn)行充分評(píng)價(jià)。本研究結(jié)果表明，復(fù)方芪苓配方顆粒可以顯著降低尿酸性腎病大鼠血清肌酐、尿素、尿酸水平（P＜0.05 或P＜0.01），證實(shí)其可改善腎功能，對(duì)腎臟具有一定的保護(hù)作用。此外，復(fù)方芪苓配方顆粒高、中劑量組可在一定程度上抑制尿酸性腎病模型大鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性，然而與別嘌醇組比較存在顯著性差異，推測(cè)其除抑制肝臟黃嘌呤氧化酶活性之外，還存在其他降尿酸機(jī)制。

研究表明，人體內(nèi)約70%的尿酸鹽通過(guò)腎臟排泄[13]。近年研究發(fā)現(xiàn)，腎臟中存在多種與尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與尿酸排泄[14]。尿酸鹽是主要在腎小管中通過(guò)OAT1 轉(zhuǎn)運(yùn)的一種內(nèi)源性有機(jī)陰離子，研究表明，下調(diào)腎臟OAT1 的表達(dá)可以使腎臟產(chǎn)生炎癥，使腎臟有機(jī)陰離子的分泌減少[15]。OCT2 主要分布在腎臟近曲小管，介導(dǎo)多種有機(jī)陽(yáng)離子的吸收與重吸收[16]。有研究表明，上調(diào)OCT2 可有助于抗高尿酸血癥且對(duì)高尿酸血癥合并腎功能不全有腎臟保護(hù)作用[17]。Hosoyamada 等[18]通過(guò)對(duì)小鼠敲除URAT1基因的研究顯示，其尿中尿酸/肌酐濃度比顯著高于正常小鼠，表明腎臟對(duì)尿酸的重吸收減弱。本研究結(jié)果表明，復(fù)方芪苓配方顆粒高劑量組能顯著升高大鼠腎臟OAT1、OCT2 蛋白的表達(dá)，且復(fù)方芪苓配方顆粒高、中劑量組可顯著降低大鼠腎臟URAT1 蛋白的表達(dá)，因此推斷其降尿酸的作用機(jī)制還可能與調(diào)節(jié)尿酸性腎病模型大鼠腎臟OAT1、OCT2 及URAT1 蛋白的表達(dá)水平相關(guān)。

表3 復(fù)方芪苓配方顆粒對(duì)尿酸性腎病模型大鼠腎臟組織OAT1、OCT2、URAT1 蛋白表達(dá)的影響（）

表3 復(fù)方芪苓配方顆粒對(duì)尿酸性腎病模型大鼠腎臟組織OAT1、OCT2、URAT1 蛋白表達(dá)的影響（）

注:正常對(duì)照組、模型對(duì)照組予蒸餾水20mL/kg 灌胃；別嘌醇組予別嘌醇10.5mg/kg 灌胃；復(fù)方芪苓配方顆粒高、中、低劑量組分別按9.6、4.8、2.4g/kg 灌胃；OAT1 為有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1；OCT2 為有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2；URAT1 為尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體1；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型對(duì)照組比較，bP＜0.01；與別嘌醇組比較，cP＜0.01

綜上所述，復(fù)方芪苓配方顆粒能顯著降低尿酸性腎病模型大鼠的血清肌酐、尿素、尿酸水平，抑制肝臟黃嘌呤氧化酶活性，上調(diào)其腎臟OAT1、OCT2 及下調(diào)URAT1 蛋白表達(dá)，提示其具有明顯的降尿酸功效，且對(duì)腎功能有一定的保護(hù)作用。其降尿酸的作用機(jī)制可能與通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶活性減少尿酸合成，并通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟尿酸鹽相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)增加腎臟尿酸鹽的分泌、降低腎臟對(duì)尿酸鹽的重吸收能力從而增加尿酸排泄有關(guān)。