杭州和泰安地區3個甜櫻桃品種花器官發育質量比較分析

沈國正，劉輝，張琛，郗篤雋，裴嘉博，黃康康

（杭州市農業科學研究院園藝研究所，杭州 310024）

甜櫻桃（Pruns aviumL.），俗稱大櫻桃，是我國北方落葉果樹中果實成熟最早的樹種之一，集中栽培于泰安、煙臺、大連等地。近10年來，甜櫻桃栽培區域已逐漸向南方地區擴展，包括長江中下游的江浙滬地區。南方地區春季升溫早、快，甜櫻桃露地栽培可比北方更早上市；同時，隨著“休閑采摘”果樹種植模式的興起，南方地區甜櫻桃產業發展前景廣闊。但在生產實踐中，南方地區甜櫻桃栽培存在坐果率低、結實不良和畸形果多等問題。

花器官尤其是雌雄配子體的發育與坐果、果實品質密切相關。雌雄配子體的正常發育，可為后續授粉受精、坐果和果實正常發育奠定良好基礎，否則將導致坐果率低、果實畸形、小果等現象發生[1]。王世平等[2]和李勃等[3]對上海地區甜櫻桃花器官的研究表明，胚珠、胚囊發育不良比例高是上海甜櫻桃不能正常結實的主要原因。由于前人對這一問題的研究多集中于南方地區種植的甜櫻桃需冷量不足[4-5]和高溫對花芽分化過程的影響方面[6-7]，但關于南方引種區與適栽區的甜櫻桃花器官與花粉發育質量間的差異還未見報道。因此，本文在課題組前期研究基礎上，選取每年均有一定坐果率但不穩定、低溫需冷量不同的3個代表性甜櫻桃品種為試驗材料，對比了相同甜櫻桃品種在杭州（南方地區）和泰安（北方地區）雌雄配子體的發育狀況、花器官的發育質量及花粉質量，以期揭示杭州地區甜櫻桃坐果率低的原因，為今后杭州地區及類似生境區域甜櫻桃種植制定合理的增產措施、調控其生長發育和達到穩產優產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試用甜櫻桃分別種植于浙江省杭州市新登鎮甜櫻桃研究基地（29°58′11.49″N，119°43′46.66″E）、山東省泰安市高新區紅旗櫻桃合作社種植基地（36°11′07″N，117°06′51″E），供試品種分別為‘薩米脫’（‘Summit’）、‘布魯克斯’（‘Brooks’）、‘拉賓斯’（‘Lapins’），樹齡均為 4 a。杭州基地內甜櫻桃采用起壟、避雨栽培方式：定植壟高45 cm、寬150 cm，株距3 m，單行種植；避雨棚為單拱圓形鋼管大棚，棚跨度4 m、肩高3.6 m、脊高4.5 m，夏季遮陽。泰安基地內甜櫻桃采用當地常規栽培方式，露天栽培，株行距3 m×4 m。

1.2 測定指標及方法

甜櫻桃物候期觀察：分別觀察并記錄2個地區各品種甜櫻桃花芽萌發期、芽鱗開裂期、現蕾期及開花期。其中：以全樹5%花芽萌動記錄為花芽萌發期，全樹5%芽鱗開裂記錄為芽鱗開裂期，全樹5%現蕾記錄為現蕾期，全樹5%開花記錄為開花期。

花器官質量測定：開花當日采集各品種花20～30朵，用游標卡尺測量并記錄每個品種的雌雄蕊長度、子房直徑、雄蕊數目等指標。

花粉質量測定：于花期采集不同品種即將開放的大花蕾帶回實驗室，及時剝取花藥，攤在硫酸紙上陰干后裝于玻璃小瓶中，于4℃條件下貯存，備用。花粉質量包括花粉量、花粉活力及花粉萌發率等指標。

花粉量的測定參照沈根華等[8]的方法并略有修改：隨機取飽滿、未開裂花藥50粒放入2 mL離心管中，重復3次。在25℃環境中放置24 h至花粉完全散出，加入200 g/L六偏磷酸鈉溶液2 mL，在漩渦振蕩器上振蕩成懸浮液。取懸浮液400 μL于2 mL離心管中，加入200 g/L六偏磷酸鈉溶液1 600 μL并搖勻，取5 μL于載玻片上，然后置于AE2000倒置生物顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）下觀察，統計花粉粒數，重復3次。每枚花藥的花粉量（花粉粒/花藥）=每個載玻片上總花粉粒數×40。

花粉活力的測定采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）法并稍加改進：取少量花粉到500 μL含0.5%TTC溶液中，混勻，然后置于35℃恒溫箱中（避光），染色24 h后吸取少量溶液到載玻片上，蓋上蓋玻片并在BX53光學顯微鏡（奧林巴斯株式會社，日本）下觀察。分別統計3個視野。花粉活力/%=（著色花粉數/觀察花粉數）×100。

花粉萌發率的測定參照姜雪婷等[9]的方法并略有修改：將培養液（蒸餾水+20%蔗糖+0.1%硼酸，pH 6.5）滴于具圓形凹槽的載玻片上，用樣品針蘸取適量花粉播于培養液中，然后將載玻片置于底部墊有濕潤濾紙的培養皿內，于25℃條件下培養4 h后終止培養。利用BX53光學顯微鏡觀察花粉萌發情況，每個品種3次重復。每個重復觀察不少于3個視野，每個視野花粉粒不少于30個，以花粉管長度大于花粉粒直徑視為萌發。萌發率/%=已萌發花粉數/花粉總數×100。

花芽分化期及花期溫度記錄：用Testo 176自動記錄儀分別記錄泰安、杭州兩地甜櫻桃花芽分化期和花期的日最高氣溫和最低氣溫；自落葉開始計算有效低溫積累量，采用0～7.2℃模型評價需冷量。

1.3 數據統計分析

采用Excel 2016和DPS 14.5軟件對數據進行統計分析，采用單因素方差分析中的鄧肯法比較不同處理間的差異顯著水平。

2 結果與分析

2.1 杭州和泰安地區甜櫻桃花期物候期差異比較

于花芽萌動前對兩地甜櫻桃品種花器官發育階段物候期觀察記錄的結果（表1～2）表明，2017年‘薩米脫’‘布魯克斯’‘拉賓斯’3個品種在杭州地區從花芽萌動至開花分別需要27、23、25 d，在泰安地區分別需要24、23、25 d。其中，杭州地區‘薩米脫’花器官發育所需時間最長，該品種花器官發育所需天數長于泰安地區。2018年3個品種甜櫻桃花器官發育時間較2017年長，‘薩米脫’‘布魯克斯’‘拉賓斯’在杭州地區分別需要30、27、27 d，在泰安地區分別需要26、25、26 d。結合2年數據可知，杭州地區3個品種從花芽萌動至開花需23～30 d，泰安地區花芽萌動雖較杭州地區晚，但花器官整體發育所需天數較杭州短1～4 d。3個品種發育進程間隔2～3 d，其發育進程速率為‘布魯克斯’＞‘拉賓斯’＞‘薩米脫’。

2.2 杭州和泰安地區甜櫻桃雌雄配子體發育過程分析

通過石蠟切片觀察可知，兩地區3個品種甜櫻桃在落葉前出現胚珠原基的突起，均以胚珠原基形態越冬，在休眠期內都無明顯形態變化。花芽萌動后，雌配子體發育經過胚珠原基、胚珠分化初期、分化出珠心和珠被、分化出大孢子母細胞、胚囊發育5個階段，直至胚發育成熟。雄配子體方面，兩地區3個品種甜櫻桃均以小孢子母細胞形態越冬，在休眠期內都無明顯形態變化；但在同一花藥的不同藥室，小孢子母細胞的發育階段不同，同一花序、不同花朵的發育狀態不同。于花芽萌動后，雄配子體發育經過小孢子母細胞、四分體、花粉粒3個階段，直至花粉發育成熟。結合物候期的記錄及石蠟切片對比可知甜櫻桃花芽分化期內外形態變化，其中：雄配子體約于花前1周發育為成熟的花粉粒，此時花芽外觀為現蕾期；雌配子體于花前0 d完成胚珠與胚囊的發育。

據不完全統計，每年到林畬鄉旅游參觀的游客有5萬余人次，其中包括前來研學旅行的學生，前來接受紅色文化、廉政文化教育的群體和自駕游群體，以后還將有前來進行“醫康養”項目的老年群體等，這意味著林畬鄉的旅游產業將會逐漸壯大。

表1 2017年度杭州和泰安地區3個甜櫻桃品種花器官發育階段物候期調查結果Table 1 Phenological calendar of three sweet cherry cultivars during floral organ development in Hangzhou and Tai'an areas in 2017

表2 2018年度杭州和泰安地區3個甜櫻桃品種花器官發育階段物候期調查結果Table 2 Phenological calendar of three sweet cherry cultivars during floral organ development in Hangzhou and Tai'an areas in 2018

圖1 杭州地區甜櫻桃雄配子體的異常發育類型Fig.1 Abnormal development types of male gametophyte of sweet cherries in Hangzhou area

對兩地區甜櫻桃雌雄配子體在各個階段發育的比較發現，相同品種在兩地間的差異表現為部分發育時期的異常發育狀況。由圖1可知：杭州地區甜櫻桃雄配子體在單核及二核花粉發育階段部分發生退化或降解，形成多種發育異常類型，此類型將導致雄配子體敗育，在后期花粉粒成熟階段觀察到花粉囊中形成的花粉極少，幾乎為空花粉囊，且比例較高；而泰安地區甜櫻桃雄配子體花粉囊均較飽滿。花粉囊是貯藏花粉的場所，花粉囊中花粉粒數量較少可能與前期發育階段發生的降解有關。空花粉囊或花粉囊中花粉較少表明杭州地區甜櫻桃的花粉粒數量較少。同時，杭州地區甜櫻桃雌配子體的胚珠和胚囊發育狀況也較差，出現胚珠退化、大孢子母細胞在發育過程中退化、無胚囊發育等異常類型（圖2）。對杭州地區雌配子體切片進行統計并對2年數據的平均值進行分析發現：‘薩米脫’‘布魯克斯’‘拉賓斯’正常發育比例僅為25.33%、16.46%、13.33%，大部分為有胚珠、無胚囊的雌配子體類型（‘薩米脫’68.00%、‘布魯克斯’67.08%、‘拉賓斯’82.50%），剩余的為無胚珠類型，而后2種發育類型均為雌配子體敗育類型。說明杭州地區甜櫻桃雌配子體敗育比例較高，具有正常發育為成熟胚囊的雌配子體較少。而泰安地區甜櫻桃雌配子體胚囊發育正常的占大多數，少數為有胚珠無胚囊或無胚珠類型。

圖2 杭州地區甜櫻桃雌配子體的異常發育類型Fig.2 Abnormal development types of female gametophyte of sweet cherries in Hangzhou area

2.3 杭州和泰安地區甜櫻桃花器官發育質量比較

由表3可知：2017年杭州地區品種間每個花序平均花朵數無顯著差異，雄蕊長度差異顯著，其中‘布魯克斯’最短，為8.38 mm；‘薩米脫’和‘拉賓斯’在雌蕊長度、子房直徑、雄蕊數間無顯著差異。泰安地區品種間子房直徑無顯著差異，雌蕊長度差異顯著，其中‘薩米脫’最短，為11.61 mm；‘薩米脫’和‘布魯克斯’在每個花序平均花朵數和雄蕊數間均無顯著差異。相同品種花器官大小在兩地存在一定的差異：泰安地區‘薩米脫’雄蕊長度和雄蕊數均大于杭州地區；‘布魯克斯’每個花序平均花朵數和雄蕊數在兩地間無顯著差異，其雄蕊長度在泰安地區大于杭州地區，而雌蕊長度和子房直徑恰好相反；‘拉賓斯’雄蕊長度和雄蕊數在兩地間無顯著差異，而其雌蕊長度在泰安地區大于杭州地區，每個花序平均花朵數和子房直徑則分別為泰安地區少于和小于杭州地區。

表3 2017年度杭州和泰安地區3個甜櫻桃品種花器官發育質量調查Table 3 Investigation on floral organ quality of three sweet cherry cultivars in Hangzhou and Tai'an areas in 2017

由表4可知：2018年不同地區相同品種間差異表現在‘薩米脫’除雄蕊數外其余參數在兩地間無顯著差異，‘布魯克斯’雄蕊長度和子房直徑在兩地間差異顯著，‘拉賓斯’雌蕊長度和子房直徑在兩地間差異顯著。在子房直徑方面，泰安地區3個品種均顯著小于杭州地區，但2018年均大于2017年。

表4 2018年度杭州和泰安地區3個甜櫻桃品種花器官發育質量調查Table 4 Investigation on floral organ quality of three sweet cherry cultivars in Hangzhou and Tai'an areas in 2018

由兩地各品種雙雌蕊率統計結果（表3～4）可知：2017年杭州地區‘拉賓斯’雙雌蕊率最高，為23.97%，‘布魯克斯’最低，為16.67%，而泰安地區‘拉賓斯’為9.09%，‘布魯克斯’為0。2018年杭州地區‘拉賓斯’雙雌蕊率最高，為43.14%，而在泰安地區其雙雌蕊率僅為4.00%，其余品種在不同地區間雙雌蕊率也不同：杭州‘薩米脫’為3.64%，而在泰安未觀察到雙雌蕊現象；杭州‘布魯克斯’為12.00%，而泰安為6.67%。

此外，田間試驗觀察發現：杭州地區甜櫻桃雄蕊雌蕊化比例較高，為3%～9%。雌蕊則表現為多種異常發育類型：在現蕾期可見雌蕊伸出花苞；雌蕊無花柱，子房退化；雌蕊花柱極短且無柱頭；多雌蕊等（圖3）。以上現象在泰安地區調查中暫未發現。

圖3 杭州地區甜櫻桃花期異常觀察Fig.3 Abnormal development during flowering stage of sweet cherries in Hangzhou area

2.4 杭州和泰安地區甜櫻桃花粉質量比較

從表5可以看出：2017年度杭州地區3個甜櫻桃品種的花粉活力和花粉量無顯著差異，但‘薩米脫’花粉萌發率顯著較低；泰安地區品種間花粉量差異不顯著，而‘薩米脫’的花粉活力和萌發率顯著低于另2個品種。兩地間的差異表現為，杭州地區甜櫻桃花粉活力和萌發率均高于泰安地區，而花粉量則前者較低。杭州地區花粉量較低，顯然與其雄配子體發育過程中空花粉囊比例較高相吻合，表明雄配子體發育異常會直接影響花期花粉量。

2018年度的結果（表6）表明：杭州地區‘薩米脫’除花粉活力外，花粉量和萌發率均顯著低于泰安地區；杭州地區‘布魯克斯’花粉質量3個參數的值均低于泰安地區，其中花粉活力和花粉量顯著低于后者；杭州地區‘拉賓斯’花粉質量3個參數的值亦低于泰安地區，其中花粉量和萌發率與后者差異顯著。可見，杭州地區甜櫻桃花粉的整體質量較差。

2.5 杭州和泰安地區甜櫻桃開花坐果期溫度比較

圖4～5為杭州、泰安兩地區2017、2018年甜櫻桃花芽萌動前1周至盛花期的最高與最低溫度。2017年在此段時期內杭州地區最高溫超過20℃的時間為12 d，泰安為8 d；2018年此期間泰安地區最高溫度變化曲線與杭州地區較為貼合，兩地最高溫度相差不大：杭州地區最高溫超過20℃的時間為16 d，泰安為14 d。進一步統計開花期溫度可知，2017年杭州地區（3月31日—4月8日）最高溫為27℃，超過20℃的有7 d，泰安地區（4月2—8日）最高溫為24℃，超過20℃的有4 d。2018年，杭州地區（3月26—30日）最高溫為27℃，超過20℃的有5 d，泰安地區（3月28—31日）最高溫為29℃，高于杭州地區，超過20℃的有4 d。

另外，對杭州地區甜櫻桃休眠期（12月—翌年2月底）通過0～7.2℃模型計算，結果表明：2016—2017年杭州地區3個月的低溫累積量為1 033 h，2017—2018年可達1 108 h。

3 討論

胚胎學研究已表明，種子敗育主要表現在：雌雄配子體的不育性、自交或異交的不親和造成的授粉受精不良、胚中途敗育[10]。其中，雌雄配子體的正常發育是形成種子與坐果的首要條件，因此，在果樹生產中對花而不實、坐果率低的研究多集中在各個樹種和品種雌雄配子體的發育特征方面。本研究中，杭州地區甜櫻桃雄配子體在發育過程中出現較高比例的空花粉囊，造成杭州地區花粉量較少；在二核細胞階段觀察到有退化、降解及多種發育異常的類型，造成后期雄配子體的敗育。此外，杭州地區甜櫻桃雌配子體中胚珠和胚囊的發育狀況極差，存在較高比例的有胚珠無胚囊類型，以及部分珠心和珠被細胞提前解體退化。由此推斷，雌雄配子體發育過程中的異常導致敗育是造成杭州地區坐果率低的主要原因。這與王世平等[2]對上海地區甜櫻桃子房切片的觀察結果相似：上海地區甜櫻桃正常發育的子房類型僅占1.8%，大部分（71.9%）為有胚珠無胚囊類型，剩余26.3%為無胚珠無胚囊類型，上海地區甜櫻桃胚珠及胚囊極差的發育狀況是該地區甜櫻桃花而不實的原因。在其他果樹品種上也曾有類似報道：蓋縣李雌配子體敗育的特征主要表現在胚囊的發育受阻及滯后、成熟胚囊結構的異常、珠心和珠被細胞提前解體3個方面[11]。杧果胚囊在七細胞八核時期出現營養細胞的退化，造成幼胚敗育等[12]。黃金梨在四分體及其分離后形成無核細胞或形成的細胞液化不能形成較硬的外壁而解體是其花粉敗育的主要原因[13]。

表5 2017年度杭州和泰安地區3個甜櫻桃品種花粉質量測定結果Table 5 Determination result on pollen quality of three sweet cherry cultivars in Hangzhou and Tai'an areas in 2017

表6 2018年度杭州和泰安地區3個甜櫻桃品種花粉質量測定結果Table 6 Determination result on pollen quality of three sweet cherry cultivars in Hangzhou and Tai'an areas in 2018

圖4 2017年度杭州和泰安地區甜櫻桃花期最高溫度與最低溫度Fig.4 Maximum/minimum temperature during flowering stage of sweet cherries in Hangzhou and Tai'an areas in 2017

圖5 2018年度杭州和泰安地區甜櫻桃花期最高溫度與最低溫度Fig.5 Maximum/minimum temperature during flowering stage of sweet cherries in Hangzhou and Tai'an areas in 2018

花器官發育質量和花粉質量直接影響坐果率。在杭州地區田間試驗中觀察到的甜櫻桃柱頭外露現象在果樹中較少提及，在生產中一般認為有利于授粉。本研究認為，柱頭外露在杭州地區不一定能提高產量，反而會使柱頭受到冷空氣影響，導致授粉能力降低或因凍傷直接敗育，以致坐果率進一步降低。少部分雌蕊無花柱、子房退化、極短花柱或無柱頭等異常發育類型均屬于雌蕊敗育，無法授粉坐果。同時，在試驗中還觀察到部分雄蕊雌蕊化現象。此類異常現象在泰安地區暫未觀察到。本研究中觀察到的花器官異常現象及花粉質量測定結果均表明杭州地區甜櫻桃花器官發育質量較差。

通常認為，冬季低溫不足是溫暖地區甜櫻桃花器官尤其是胚珠胚囊發育不良、坐果率低的主要原因[5]。在本試驗中杭州地區甜櫻桃休眠期內（12月—翌年2月底）低溫累積量分別為1 033 h（2016—2017年）和1 108 h（2017—2018年）。為使需冷量表達更客觀和準確，使用區間方式[14-15]劃分本試驗中選用的3個甜櫻桃品種的需冷量，分別為：‘拉賓斯’200～400 h，‘布魯克斯’600～800 h，‘薩米脫’＞1 200 h。由此可知，除‘薩米脫’需冷量未滿足要求外，其余2個品種的低溫需求均能得到滿足。說明需冷量不足并不是杭州地區甜櫻桃坐果率低的主要原因。

對于造成雌雄蕊敗育的原因，前人的大量研究集中在溫度對它的影響方面[16-18]。高溫對雄配子體的影響則主要表現為對絨氈層的影響。絨氈層作為小孢子正常發育的營養供體，與小孢子的發育存在著同步協調性[19-20]。李燕等[21]指出，高溫雖對花器外觀造成損傷如雌蕊干枯變褐，但對胚珠和胚囊發育的影響并不明顯，可能與高溫處理時期及時長有關。在本研究中，對兩地花芽萌動至盛花期間溫度統計可知，兩地在此期間內最高溫差異不明顯，且在2017和2018年杭州地區雌雄配子體發育正值二核細胞向成熟花粉粒轉化和胚囊發育時期，本地區均溫度驟降，不存在遭受高溫影響現象，因此推斷，溫度并不是直接導致杭州地區甜櫻桃雌雄配子體敗育率高的因素。溫度是影響植物花芽發育、雌雄配子體質量最重要的環境因素之一，其對花芽營養物質、內源激素水平等方面的影響有待于進一步研究。

4 結論

在杭州地區甜櫻桃花器官發育過程中觀察到雄配子體中較高比例的空花粉囊，造成花粉量較少，且花粉發育過程中的退化、降解以及多種發育異常類型造成后期雄配子體的敗育；雌配子體發育成有胚珠無胚囊類型的比例較高，造成雌配子體的敗育。杭州地區甜櫻桃花粉質量較低，田間觀察可見多種雌雄蕊發育異常類型。由此可見，杭州地區甜櫻桃花器官整體發育質量較差，雌雄配子體發育異常是該地區甜櫻桃坐果率低、結實困難的主要原因，但引起其發育異常的生理機制需進一步研究。