蛋白酶對黃酒發酵的影響及揮發性成分分析

陳 通，芮鴻飛，葉林林，胡 浩，郭 儉，劉興泉，

（1.浙江農林大學林業與生物技術學院，浙江杭州 311300；2.杭州市臨安區疾病預防控制中心，浙江杭州 311300；3.浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江杭州 311300）

黃酒是世界三大古酒之一[1]，是以麥曲為主要糖化劑，經長期陶壇陳釀而成的風味飲品，獨特的釀造工藝造就了黃酒獨有的風味特征[2-3]。麥曲是黃酒發酵中最常用的糖化發酵劑，除積累了根霉、米曲霉、細菌及其代謝產物外，還富含糖化酶、淀粉酶、蛋白酶等酶類[4]。在黃酒釀造過程中，麥曲中的各種酶系將原料中淀粉、蛋白質等降解為酵母及其他微生物可利用的營養物質，同時為黃酒增香[5]。

隨著釀酒工業的發展，酶制劑廣泛應用于發酵酒的生產中。啤酒中，酶制劑主要用于啤酒澄清[6]；葡萄酒中，主要集中于增香劑的研發[7-9]；黃酒同為三大古酒，主要集中在酸性蛋白酶的研究上。酸性蛋白酶能加速蛋白質的水解，增加可利用的氮源，促進酵母生長并有效控制乳酸菌等雜菌的繁殖，從而減少了酸、醛等副產物的產生[10]；且黃酒醪液中酒精度、氨基酸態氮含量與酸性蛋白酶的添加量成正比[11-12]。蛋白酶促進游離氨基酸的釋放,提高黃酒揮發性成分的形成，顯著改變黃酒風味組成[13-14]。

為進一步探究蛋白酶在黃酒生產中應用的可行性，本試驗選取3 種食品級蛋白酶（風味蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶），探討蛋白酶的添加對黃酒發酵及揮發性成分的影響，為提升黃酒風味品質提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米，安徽南陵米業有限公司；黃酒高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；麥曲，紹興古越龍山黃酒股份有限公司；風味蛋白酶（20000 U/g）、中性蛋白酶（60000 U/g）、復合蛋白酶（120000 U/g），北京索萊寶科技有限公司；2-辛醇（純度＞99.8%），美國sigma公司。

1.2 儀器與設備

氣相色譜-質譜聯用儀：QP-2010 GC/MS，日本島津公司，配RTX-WAX 毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm）；100 μm PDMS 萃取頭及SPME手動柄，美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃酒釀造工藝流程

1.3.2 黃酒發酵實驗

糯米∶水∶麥曲∶酵母=500∶500∶50∶1，以風味蛋白酶添加量100 mg/L[15]為基準，控制3 種蛋白酶的酶活當量相同，中性蛋白酶、復合蛋白酶的添加量分別為33.3 mg/L、16.7 mg/L。

蛋白酶經50 ℃活化30 min 后，與黃酒活性干酵母混勻后接種于酒壇；30 ℃有氧糖化3 d，每12 h開耙1 次；前酵（4～7 d，15 ℃密封發酵，每48 h 開耙1 次）；中酵（8～12 d，15 ℃密封發酵，每3 d 開耙1 次，）；后酵（13～34 d，15 ℃密封發酵），發酵結束后90 ℃滅菌30 min，灌裝待測。

1.3.3 黃酒常規指標的測定

總糖、總酸、酒精度的測定參考國標GB/T 13662—2018《黃酒》。

1.3.4 黃酒揮發性成分的測定[16]

1.3.4.1 樣品處理

PDMS 萃取頭使用前先在氣相色譜進樣口250 ℃活化30 min；20 mL 頂空瓶中準確加入5 mL黃酒樣品、5 mL 去離子水和20 μL 內標2-辛醇（1.143 mg/mL 乙醇溶液），加蓋密封墊和鋁帽，50 ℃預熱5 min 后，PDMS 萃取頭萃取吸附30 min，進樣口250 ℃條件下GC解析15 min。

1.3.4.2 色譜條件

GC 條件：色譜柱為RTX-WAX 彈性石英毛細管柱(30 m×0.35 mm×0.25 μm)，以氦氣(99.999%)為載氣，恒定流速為1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃，不分流進樣；柱溫采用程序升溫，初始溫度為40 ℃，保持5 min，以6 ℃/min 升溫到120 ℃，保持5 min，再以3 ℃/min升溫到190 ℃，保持5 min。

MS 條件：EI 源，電子能量70 eV，全掃描模式采集數據，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍為40～500 u，溶劑切除3 min。

1.3.4.3 定性定量方法

采用NIST08 和NIST08s 標準圖譜庫進行檢索，以匹配度大于80%作為檢索結果；以檢測出物質的峰面積與內標2-辛醇峰面積的比值來確定揮發性成分的相對含量。按照以下公式計算各種揮發性香氣成分相對含量：

其中：Ai——各種香氣成分對應峰面積；

Aj——內標峰面積。

1.3.5 酵母菌的計數

采用血球計數板計數法。

1.3.6 數據分析

采用Excel 2016 和SPSS 22.0 軟件進行數據統計分析，用TBtools 和GraphPad 8.0 軟件作圖，每組試驗設置3 組重復，結果以均值±標準差（means ±SD）表示，在p ＜0.05水平上差異顯著。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的添加對黃酒發酵過程的影響

測定了黃酒發酵過程中總糖和酵母菌數，結果見圖1。由圖1 可知，添加風味蛋白酶能顯著提高總糖的利用率，而復合蛋白酶的添加使總糖的消耗速率下降。處理組與對照組的酵母菌數變化趨勢相似，在發酵第7 天達到最高值，在第16 天趨于穩定。其中風味蛋白酶顯著地促進了酵母菌的生長，最高峰值達3.18×108cfu/mL，比對照組上升了15.7%，并在后期穩定時保持較高的水平，為1.68×108cfu/mL。風味蛋白酶促進糯米中大分子的蛋白質水解成小分子肽和游離氨基酸，更易于被酵母吸收利用[17]，促進酵母生長，并提高酵母細胞對糖的轉化速率[18]。酵母可利用氮源的缺乏或過量都會影響細胞的生長，而且氮源水平與細胞生長速度呈正相關[19-21]。

黃酒總糖、總酸、酒精度和氨基酸態氮含量結果見圖2。酒精度是基于醪液發酵過程中酵母細胞所轉化的糖總量。由圖2 可知，添加風味蛋白酶所釀黃酒的氨基酸態氮與酒精度最高，總糖、總酸含量最低。其中氨基酸態氮含量為0.43 g/L，酒精度為15.1%vol，較對照組分別上升了30.3%、5.6%，結合總糖含量變化規律（圖1a），說明風味蛋白酶的添加促進酵母生長，使得更多的糖轉化為酒精，與蔡小云的研究結果相似[22]。添加風味蛋白酶的黃酒總酸為6.6 g/L，較對照組下降了8.3%，而添加中性蛋白酶與復合蛋白酶的黃酒總酸與對照組差異不顯著。

表1 添加蛋白酶黃酒揮發性成分的分析

2.2 蛋白酶的添加對黃酒揮發性成分的影響

黃酒有著獨特的香氣特征，其中醇、酸、酯類物質是主要的香氣物質，起香氣骨架的作用[23-25]。采用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用儀（HSSPME-GC/MS）測定了黃酒揮發性物質，篩選了32種主要的揮發性成分（14 種酯、10 種醇、4 種酸和4種其他物質）進行分析，結果見表1。與對照組相比，添加蛋白酶顯著促進了高級醇和酯的合成，抑制了酸的合成。其中，添加風味蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶對總酯的促進率分別為97.6%、155.1%、261.0%。蛋白酶增加了醪液中的氨基酸態氮含量（見圖2b），促進了酵母細胞對氮源的吸收利用，從而增強了風味物質的形成。在黃酒發酵過程中，提高醪液中氮源水平可促進酯的形成[26-27]。

2.3 黃酒揮發性成分的主成分及聚類熱圖分析

對表1 中32 種香氣物質進行主成分及聚類熱圖分析，結果見圖3。主成分分析表明不同酒樣與風味物質之間的聯系。圖3a 顯示風味物質分布在4 個象限中，其中肉豆蔻酸乙酯（r=0.999）、琥珀酸二乙酯（r=0.992）、己酸乙酯（r=0.990）、乙酸異戊酯（r=0.987）和乙酸乙酯（r=0.982）等物質集中分布在第一象限，均對第一主成分（PC1）、第二主成分（PC2）有較大的正向影響。結合圖3b 表明這類物質與添加風味蛋白酶的黃酒有較大的相關性，說明風味蛋白酶能促進黃酒中肉豆蔻酸乙酯、琥珀酸二乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸乙酯等物質的生成并改善黃酒的風味品質。

表2 10種黃酒揮發性成分香氣活力值的評價

聚類熱圖結果見圖3c，不同顏色表示各香氣化合物的含量差異，紅色表示含量高，綠色表示含量低。基于香氣化合物含量進行聚類，結果顯示，32種化合物在不同酒樣中的分布可以聚為4 類。其中化合物含量C 類＞D 類＞A 類＞B 類。在不同黃酒樣品中差異最顯著的是C 類化合物，包括異戊醇、乙酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、丁酸乙酯和棕櫚酸乙酯，與對照組相比，蛋白酶的添加顯著提高了這些化合物的含量。

2.4 黃酒香氣貢獻率的分析

為了進一步比較各香氣化合物對黃酒整體香氣的貢獻，根據文獻[28-33]報道中各香氣化合物的香氣描述及香氣閾值濃度，計算各香氣化合物在黃酒中的OAVs，結果見表2。丁酸乙酯、乙酸異戊酯和己酸乙酯等化合物具有濃郁的水果香，添加蛋白酶后其OAVs＞1，表明這些香氣物質對黃酒香氣特征具有明顯的貢獻。其中風味蛋白酶對乙酸異戊酯、己酸乙酯和癸醛的貢獻率促進效果最好，分別是對照組的5.6 倍、1.3 倍、1.5 倍；復合蛋白酶對丁酸乙酯、棕櫚酸乙酯的貢獻率提升最顯著，分別是對照組的30.2倍、3.31倍。

4-乙基愈創木酚具有典型的辛辣、刺激的煙氣味，是構成我國黃酒“煙氣香”風味特征的重要香氣化合物[34]。黃酒中酚類化合物可能主要來自植物原料中木質素及其他植物次級代謝產物[35]。中性蛋白酶、復合蛋白酶增加了4-乙基愈創木酚在黃酒中的貢獻率，分別是對照組的1.2 倍、1.3 倍，而風味蛋白酶抑制了4-乙基愈創木酚的產生，消除了辛辣、刺激氣味，營造了濃郁協調的香氣氛圍。

3 結論

蛋白酶的添加顯著影響黃酒發酵，其中風味蛋白酶最顯著。與對照組相比，風味蛋白酶促進了蛋白質分解，氨基酸態氮含量增加了30.3%，酵母菌數上升了15.7%，酒精度增加了5.6%，總酸下降了8.3%；中性蛋白酶的促進效果比不上風味蛋白酶；而復合蛋白酶提高了總酸含量，導致黃酒酸敗。

蛋白酶的添加可顯著促進高級醇和酯的形成。通過主成分與聚類熱圖分析發現，風味蛋白酶促進β-苯乙醇、異戊醇、乙酸乙酯、琥珀酸二乙酯等香氣物質的生成，這類物質集中分布在第一象限，對PC1、PC2 均有正向作用。風味蛋白酶提高了異戊醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯等物質對黃酒整體香氣的貢獻（OAVs 增大），降低了辛辣、刺激氣味。而添加中性蛋白酶和復合蛋白酶的黃酒風味比不上對照組。3 種蛋白酶中，風味蛋白酶的添加能顯著改善黃酒風味品質，為提升黃酒風味品質的技術提供參考。