江南小窖宣酒釀造微生態(tài)系統(tǒng)中高產(chǎn)四甲基吡嗪功能微生物的篩選與鑒定

張溫清 ，司冠儒，梅 婕，汪家勝，李井雷，周慧佳，葉 明，夏少東，程 凡，郭志忠，周 萍

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230009；2.安徽宣酒集團(tuán)股份有限公司科研中心，安徽宣城 242000；3.江南小窖釀造工藝研究所，安徽宣城 242000）

白酒是中國的傳統(tǒng)文化飲品，開放式的傳統(tǒng)操作工藝是產(chǎn)生其獨(dú)特風(fēng)格不可或缺的。研究表明，環(huán)境微生物對白酒的釀造具有非常重要的貢獻(xiàn)[1]。不同地域環(huán)境中釀造微生物產(chǎn)生不同酒的風(fēng)格。這不但造就了中國白酒目前百花齊放、各美其美的格局，而且也賦予了不同地域的白酒具有不可復(fù)制性。同樣地，白酒的傳統(tǒng)發(fā)酵劑——大曲也是在開放性的環(huán)境中，通過富集、培養(yǎng)產(chǎn)區(qū)環(huán)境中的微生物制作而成。

四甲基吡嗪（TTMP），又名川穹嗪，是白酒中重要的風(fēng)味化合物，也是白酒中的健康功能因子[2]。白酒中TTMP 是釀造微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的銨和乙偶姻（ACT）經(jīng)過縮合反應(yīng)生成。芽孢桿菌是產(chǎn)生白酒中TTMP 的主要一類釀造微生物[3]。篩選產(chǎn)區(qū)釀造微生態(tài)系統(tǒng)中優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)TTMP 的功能菌株，制作功能麩曲或直接以強(qiáng)化菌液的形式定向擾動(dòng)傳統(tǒng)的釀造微生物菌群，提高酒體中TTMP 的含量，有利于提高產(chǎn)品品質(zhì)[4]。

本文以宣酒大曲為研究材料，以高產(chǎn)蛋白酶和TTMP 前體ACT 為篩選標(biāo)記，分離、篩選、鑒定江南小窖宣酒釀造微生態(tài)系統(tǒng)中高產(chǎn)TTMP 的芽孢桿菌，并對其應(yīng)用進(jìn)行了初步的研究。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

菌株分離材料：宣酒高溫曲與中高溫包包曲。

試劑與耗材：TTMP 和ACT 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，美國西格瑪-奧德里奇公司；甲酸（色譜純）、乙醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、有機(jī)濾膜（0.22 μm），上海安譜科學(xué)儀器有限公司；細(xì)菌基因組DNA 快速提取試劑盒，上海捷瑞生物公司。其他試劑均為分析純，購于國藥試劑有限公司。

儀器設(shè)備：液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS/MS 1260-6460）、色譜柱（ZORBAX Eclipse Plus C18Rapid Resolution 4.6×100 mm 3.5-Micron），美國安捷倫公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS 7890B-5977A）、毛細(xì)管色譜柱J&W VF-WAX(0.25 mm×25 m×0.20 μm)，美國安捷倫公司；超純水儀（A2S-10-CE），美國艾科浦國際有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，加水至1000 mL，pH 調(diào)至7.2，于115 ℃滅菌25 min。

Voges-Proskauer（V-P）培養(yǎng)基：葡萄糖5 g，蛋白胨5 g，氯化鈉5 g，加水至1000 mL，pH 值調(diào)至7.2，于115 ℃滅菌25 min。

脫脂牛奶培養(yǎng)基：A 液：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 15 g/L，pH7.2。B 液：脫脂純牛奶。A液和B 液單獨(dú)滅菌，115 ℃滅菌25 min，9∶1 混合均勻后使用。

YPG 培養(yǎng)基：葡萄糖70 g，蛋白胨30 g，酵母膏10 g，磷酸氫二銨30 g，加水至1000 mL，pH 值調(diào)至7.5，于115 ℃滅菌20 min。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g,酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，加水至1000 mL，以115 ℃滅菌20 min。

麩曲培養(yǎng)基：麩皮700 g，豆粕粉300 g，NaOH 4 g，水1 L，115 ℃滅菌25 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的篩選

分別稱取5 g 破碎后的高溫曲和中高溫包包曲粉末，加入裝有50 mL 無菌水的250 mL 三角瓶中，振蕩1 h。樣品懸浮液80 ℃水浴30 min，滅活營養(yǎng)細(xì)胞，得到芽孢懸液。吸取上述1 mL 懸液加入到裝有50 mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中，37 ℃、160 r/min 培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6后，取0.5 mL 稀釋倍數(shù)為10-4、10-5、10-6的培養(yǎng)液涂布于固體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)48 h。根據(jù)平板上菌落的形態(tài)差異，挑取具有不同特征的菌落于營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線分離純化，得到的單菌落分別接種于脫脂牛奶培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯瓊脂斜面，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，培養(yǎng)好的斜面4 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)脫脂牛奶培養(yǎng)基菌種透明圈直徑和菌落直徑比值的大小，初步判斷產(chǎn)蛋白酶能力的高低。

1.3.2 高產(chǎn)TTMP菌株的初篩

挑選脫脂牛奶培養(yǎng)基上菌株透明圈直徑和菌落直徑比值較大的菌株接種于V-P 培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h。向裝有2 mL 培養(yǎng)液的試管中加入2 mL O’Meara 試劑（含0.3%肌酸的40%NaOH 水溶液），振蕩1～2 min，于30 ℃培養(yǎng)箱靜置15 min，反應(yīng)液呈伊紅色，表明有乙偶姻或雙乙酰產(chǎn)生，分光光度計(jì)560 nm 處測定其吸光值。將具有較高A560 的菌株接種于含10 mL YPG 培養(yǎng)基的35 mL試管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。取3 mL 培養(yǎng)液于10 mL 離心管中，8000 r/min 離心5 min，收集上清液過0.22 μm水相濾膜，取1 mL左右過濾樣品于樣品瓶中，HPLC-MS/MS[3-5]測定菌株TTMP 含量，選出產(chǎn)TTMP較高的菌株進(jìn)行驗(yàn)證及復(fù)篩。

1.3.3 高產(chǎn)TTMP菌株的復(fù)篩

為了驗(yàn)證各菌株產(chǎn)TTMP 的能力，將初篩的純化菌株進(jìn)行YPG 培養(yǎng)基發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。初篩菌株接種至裝有10 mL LB 培養(yǎng)基的50 mL 搖瓶中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)液作為種子以2%的接種量接入至裝有50 mL YPG 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中，37 ℃，160 r/min 恒溫培養(yǎng)120 h。取3 mL 培養(yǎng)液于10 mL 離心管中，8000 r/min 離心20 min，收集上清液，以12%的乙醇稀釋1000 倍后，過0.22 μm 有機(jī)相濾膜，取1 mL 左右濾液于樣品瓶中，HPLC-MS/MS測定各菌株TTMP含量。

1.4 高產(chǎn)TTMP菌株麩曲固態(tài)發(fā)酵

功能菌株接種至裝有10 mL YPG 培養(yǎng)基的50 mL 搖瓶中，37 ℃培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)液作為種子液以2%的接種量接入裝有50 g 麩皮培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，37 ℃培養(yǎng)2.5 d。

適量培養(yǎng)物稱重，95 ℃烘干至恒重，計(jì)算其含水量。稱取固態(tài)培養(yǎng)物約5 g，加入12%乙醇50 mL，超聲1 h，靜置過夜。取上清液10 mL 8000 r/min 離心20 min，過0.22 μm 有機(jī)濾膜，供HPLC-MS/MS檢測。

1.5 產(chǎn)物分析

樣品中TTMP 的測定采用HPLC-MS/MS法[3-5]。樣品中ACT 的測定采用GC-MS 法[6]。培養(yǎng)物中酸性蛋白酶測定按GB/T 28715—2012 所述進(jìn)行[7]。

1.6 菌株鑒定

試劑盒法提取菌株的染色體DNA 送至上海生物工程有限公司進(jìn)行16s rDNA 和gyrB測序，NCBI比對，確定菌株的種屬類別。16S rDNA正向引物5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC TT-3’。gyrB基因正向引物5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNG GNAARTTYGA-3′，反向引 物5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’。

2 結(jié)果與討論

2.1 高產(chǎn)TTMP功能菌株初篩

乙偶姻和銨是TTMP 的前體物質(zhì)。銨的生成與蛋白酶活力的高低有關(guān)，而且蛋白酶也是曲粉的重要質(zhì)量指標(biāo)。所以，本研究篩選高產(chǎn)TTMP功能菌株是以蛋白酶和乙偶姻為篩選指標(biāo)。曲粉中獲得的典型特征單細(xì)胞菌落接種于脫脂牛奶培養(yǎng)基，挑選透明圈直徑與菌落直徑比較大的410株菌株，作為下一步V-P 反應(yīng)的菌株。將產(chǎn)蛋白酶能力較高的410 株菌株接種于V-P 培養(yǎng)基，進(jìn)行V-P 反應(yīng)，分光光度計(jì)檢測。根據(jù)A560nm大小，選取40 株較高菌株，接種于YPG 培養(yǎng)基試管中液態(tài)發(fā)酵，48 h 后，發(fā)酵液處理后進(jìn)行TTMP 的測定。結(jié)果見表1，TTMP 產(chǎn)量最高的10 株菌編號(hào)分別為XJG-021 43.79 mg/L,XJG-076 38.43 mg/L，XJB-007 30.58 mg/L，XJG-068 28.82 mg/L，XJZ-015 27.37 mg/L，XJB-012 25.82 mg/L，XJZ-042 20.57 mg/L，XJX-011 4.59 mg/L，XJB-104 3.21 mg/L，XJG-015 0.65 mg/L。

表1 各菌株初篩TTMP的產(chǎn)量

2.2 TTMP功能菌復(fù)篩——YPG搖瓶發(fā)酵

將初篩產(chǎn)量較高的10 株進(jìn)行YPG 搖瓶水平發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵5 d，結(jié)果如表2 所示。產(chǎn)量最高的菌株為XJG-076，TTMP 產(chǎn)量為214.22 mg/L。后續(xù)試驗(yàn)證明，將種子培養(yǎng)基LB 換為YPG 時(shí)，YPG 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)TTMP 更高，例如種子培養(yǎng)基為YPG 時(shí)，XJB-104 YPG 搖瓶 發(fā)酵5 d 產(chǎn)量由146.08 mg/L 提高到0.81 g/L（表3）。ACT 是微生物糖代謝途徑上的產(chǎn)物，種子培養(yǎng)基中葡萄糖的添加有利于微生物代謝產(chǎn)生、積累TTMP 的前體ACT，對提高TTMP的產(chǎn)量有益。后續(xù)麩曲固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)種子培養(yǎng)基換為YPG 培養(yǎng)基。TTMP 是ACT 和銨發(fā)生自發(fā)縮合反應(yīng)生成的，高溫可以加速這一反應(yīng)生成更多的TTMP[4]。由表3 可知，發(fā)酵結(jié)束的培養(yǎng)液，95 ℃水浴2 h，可加速培養(yǎng)液中ACT 和銨生成TTMP,如菌株XJB-104 加熱后TTMP 產(chǎn)量由0.81 g/L 提高到2.03 g/L。由表2、表3 可知，培養(yǎng)基配方的改變會(huì)影響菌株TTMP 的產(chǎn)量，同時(shí)不同菌株產(chǎn)生TTMP及其前體的能力是不同的。

2.3 TTMP功能菌株麩曲固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)

將上述10 株菌株接種于麩曲固態(tài)培養(yǎng)基，培養(yǎng)2.5 d，結(jié)果見圖1，固態(tài)發(fā)酵條件下TTMP 產(chǎn)量最高的是XJB-104，202.54 mg/kg，達(dá)到已報(bào)道的出發(fā)菌株的較高水平。結(jié)合表2 和表3，發(fā)現(xiàn)菌株在不同培養(yǎng)基質(zhì)中產(chǎn)TTMP 的能力是不同的。而且通過圖1 還可以得出，蛋白酶和ACT 單獨(dú)產(chǎn)量高，TTMP 產(chǎn)量不一定高，只有二者均較高時(shí)，TTMP 產(chǎn)量才會(huì)達(dá)到較理想的水平，這也驗(yàn)證了通過蛋白酶和ACT 來篩選TTMP 高產(chǎn)菌株策略的正確性。同時(shí)也能反映出表3 中XJB-104 與其他菌株相比，經(jīng)加熱后TTMP 產(chǎn)量增加較多，是因?yàn)槠渚哂休^強(qiáng)的ACT和銨的生產(chǎn)能力。

表2 菌株YPG搖瓶水平產(chǎn)TTMP

表3 各菌株YPG搖瓶水平產(chǎn)TTMP(種子培養(yǎng)基為YPG)

2.4 菌株鑒定

將XJB-104 接種于LB 培養(yǎng)基，過夜，試劑盒法快速提取菌株的染色體DNA，送上海生工進(jìn)行16S rDNA 測序，得到的序列在NCBI 上比對，確定菌株的種屬，XJB-104 16S rDNA比對結(jié)果見表4。

由表4 可知，XJB-104 與解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的相似度都是100%，16s rDNA 的比對結(jié)果并不能準(zhǔn)確的判定該菌的種屬。gyrB 基因是分類及鑒別細(xì)菌的新靶標(biāo)，其結(jié)果可以區(qū)分XJB-104 是枯草芽孢桿菌還是解淀粉芽孢桿菌,所以XJB-104 gyrB 基因被測序。gyrB 基因的比對結(jié)果見表5，根據(jù)比對結(jié)果，確定該菌株為解淀粉芽孢桿菌，該菌株進(jìn)而命名為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensXJB-104。同樣的方法對其他高產(chǎn)TTMP的9株菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表6。

3 結(jié)論

本研究以蛋白酶活力和TTMP 前體ACT 為篩選標(biāo)記，以宣酒大曲為分離材料，篩選了江南小窖宣酒釀造微生態(tài)系統(tǒng)中10 株高產(chǎn)TTMP 功能微生物，通過分子生物學(xué)進(jìn)行了種屬鑒定，并應(yīng)用于固態(tài)發(fā)酵麩曲培養(yǎng)基生產(chǎn)麩曲。解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens XJB-104 麩曲中TTMP 的含量達(dá)202.54 mg/kg，可以作為產(chǎn)業(yè)化的潛力菌株。

表4 菌株XJB-104 16S rDNA NCBI比對結(jié)果

表5 菌株XJB-104 gyrB NCBI比對結(jié)果

表6 10株TTMP功能菌鑒定結(jié)果