紅曲霉的初篩及在黃酒釀造中的應用

夏培禹，袁 寧，管桂坤，萬自然，劉 宇，王 濤

（山東蘭陵美酒股份有限公司，山東臨沂 277731）

紅曲霉（Monascus）是一種絲狀腐生真菌，在生長代謝過程中可利用各種碳源及氮源生成次級代謝產物紅曲色素，而紅曲色素作為一種天然的可食用色素，在我國傳統的食用和藥用市場具有很好的應用前景。王柏琴等[1]利用紅曲色素對pH值穩定、耐熱、耐光及不易被氧化還原等特性，在香腸制作中將其取代對人體有害的亞硝酸鈉用于發色，成色效果良好且穩定；Lee 等[2]已證明紅曲色素中的黃色素具有降血壓的作用，同時Su[3]發現紅曲色素具有抗腫瘤、抗癌的作用。

紅曲黃酒是最具有特色的黃酒之一，紅曲作為糖化劑加入黃酒的發酵中，可使酒液呈現特殊的色澤，酒味醇厚香濃，口感淡雅、爽口宜人，主要品牌有福建老酒、沉缸酒及義烏丹溪紅曲酒等[4]。紅曲霉在黃酒的釀造中產生的代謝產物可分泌到酒中，除含有鈣、磷、鐵等元素，還含有硒、錳、銅、鋅等微量元素，且黃敏欣等[5]研究發現，黃酒的發酵中添加紅曲，可使γ-氨基丁酸的含量增加2.16 倍，可較好的提高黃酒的營養價值。同時紅曲霉在發酵中產生的活性物質還具有阻礙膽固醇合成，降血脂，預防多種心腦血管疾病，提高免疫力、美容養顏等[6-7]功效。本文將從中溫大曲中初篩的紅曲霉，應用到黃酒的釀造中，探究其對黃酒風味口感的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

材料：中溫大曲，山東蘭陵美酒股份有限公司；黃酒專用活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；黍米，朝陽益充雜糧有限公司。

儀器設備：YXQ-LS-75SN 立式壓力蒸汽滅菌鍋；JHT-系列凈化工作臺；A-1502 分光光度計，上海譜元；MJX-280S 智能霉菌培養箱；FLY-211C 恒溫振蕩培養箱；安捷倫7890A氣相色譜儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種篩選

將含有粉紅色菌落的中溫大曲曲心粉碎，分別加入無菌水中振蕩搖勻，于60 ℃水浴中恒溫30 min以殺死不耐熱的細菌及酵母，吸取懸液用無菌水將其稀釋成10-1～10-7的不同梯度，然后各吸取200 μL 的菌懸液涂布于麥芽汁固體培養基上，每梯度做兩個平行。30 ℃恒溫培養5 d，挑取紅色菌落，進行平板劃線純化培養。然后根據菌落特征、顏色及所產香味等指標進行復篩，獲得純種單菌落。純菌接入麥芽汁瓊脂斜面培養基上備用[8]。

1.2.2 紅曲米的制備

取斜面培養的紅曲霉，接入滅菌的麥芽汁液體培養基中，于搖床150 r/min，30 ℃恒溫培養3 d，然后將活化后的菌種培養液分別進行無菌過濾計數，將其濃度調整至2×106個/L，備用[9-10]。

500 mL 錐形瓶中裝入50 g 大米，加水過夜浸泡，然后將其瀝干，于滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，冷卻后將其搖散，分別加入5 mL 調整好的2×106個/L 菌液，每組3 個平行，混勻后，30 ℃恒溫培養箱中培養48 h 左右，米粒表面發白長滿菌絲，之后每天進行兩次搖瓶，使米粒分散，約10 d 米粒表面完全紅透，烘干，獲得紅曲米成品[11]。

1.2.3 紅曲糖化力測定

糖化力的測定參照GB 1886.174—2016[12]。

1.2.4 紅曲酯化酶活力的測定[13]

測定方法為：3 mL 反應體系：乙酸對硝基苯酯240 μL（4.5 μg/μL）、粗酶液300 μL 和乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH6）2460 μL。混勻后測量OD405nm值并準確計時，在30 ℃水浴鍋中反應2 h 后終止反應，再測定1 次OD405nm，根據所得OD 值計算反應體系中的酶活（酶活力單位定義：在一定條件下每1 min 釋放出1 μmol 對硝基苯酚所消耗的酯化酶的酶量定義為一個脂肪酶活力單位（U）。

1.2.5 紅曲中紅曲色素的測定[7]

紅曲色素提取及測定方法參照GB 1886.19—2015。將粉粹混勻的0.2 g 試樣，用70%乙醇溶液溶解并將其轉入100 mL容量瓶中，定容，60 ℃水浴1 h，冷卻至室溫，用70%乙醇溶液定容，混勻后過濾，50 mL 的容量瓶中加入適量濾液，70%乙醇溶液定容，混勻后，在505 nm 的波長下測定處理后樣品中的吸光值A，并以下公式計算樣品色階：

X1=A×100/m1×50/V

式中：X1 為色階（U/g）；A 為樣品吸光值；m1 為樣品質量（g）；V為吸取乙醇浸泡液的體積（mL）。

1.2.6 發酵操作

將浸泡20 h 以上的黍米蒸熟，黍米與水以1:2的比例加入錐形瓶中，待冷至常溫，紅曲米的添加量均為原料的10%，酵母添加量為原料的1‰，混勻，放入恒溫培養箱30 ℃發酵，6 d 后測其酒度、總酸等指標。

1.2.7 黃酒風味物質檢測

采用安捷倫7890A氣相色譜儀檢測[14]。

2 結果與分析

2.1 紅曲霉菌株的篩選

通過分離、純化和形態的初步鑒定，共獲取3株紅曲霉，分別命名為Q1、Q2及Q3，然后分別加入25%甘油中，于-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 紅曲米的理化性質（表1）

表1 紅曲米的理化性質

將3 株篩選出的紅曲霉分別以大米培養，所得紅曲米的糖化力及紅曲色素如表1 所示，中溫大曲中篩選出的紅曲霉Q3 的糖化力及紅曲色素含量均明顯高于另外兩株紅曲霉，且培養的紅曲米符合GB 1886.19—2015 中對食品添加劑紅曲米（粉）產品色階≥1000 U/g 的要求。而酯化酶活力中，紅曲霉Q1的活力則最高。

2.3 紅曲釀造黃酒的理化指標（表2）

表2 黃酒的理化指標

由表2 可知，3 株篩選出的紅曲霉培養的紅曲米在黃酒發酵中的理化指標，其中總酸的含量相差不大，說明3 株紅曲霉對黃酒釀造中總酸的產生量影響不大，而酒度及還原糖的含量則有明顯的差異，紅曲霉Q3 所產酒精含量最高，且剩余總糖的含量最低，說明該組黃酒發酵中的酒精轉化率較高，而酒精轉化率較高的原因可能與紅曲霉Q3 的糖化力較高有關，可將原料較充分的糖化，以供酵母產生更多的酒精。而紅曲霉Q2 的糖化力比Q1 高，酒精的產生量卻比Q1 少，剩余總糖的含量也較高，推測可能是生成酒精的酵母在黃酒釀造中受到紅曲霉Q2 的抑制，而紅曲霉Q3 與Q1 對酵母生成酒精的影響不大，進而成為導致其酒精生成量相對少的原因。

2.4 紅曲釀造黃酒中的高級醇含量（表3）

表3 黃酒中的高級醇含量 (mg/L)

適宜的高級醇含量能賦予黃酒以柔和、醇厚、圓潤、豐滿及協調的感覺，而高級醇在體內的氧化速度比乙醇慢，因此會停留較長時間，當黃酒中含有過量的高級醇，消費者飲用黃酒易“上頭”，易醉，同時會引起腦部損傷及認知障礙[15]。由表3可以看出，3 株篩選出的紅曲霉在黃酒發酵中產生的高級醇含量存在差異性，紅曲霉Q3 在黃酒發酵中所產生的總高級醇含量明顯低于另外篩選出的兩株紅曲霉，推測可能是紅曲霉Q3 在黃酒發酵中會影響高級醇的生成途徑，或會以消耗高級醇為碳源促進自身的生長增殖，進而導致高級醇的生成量相對減少。

2.5 黃酒中乙酸及兩種相關酯的含量

酯類物質是黃酒中重要的風味物質，對黃酒的風味和品質起著關鍵性的作用，通常具有很強的水果味或花香味[16]。黃酒中酯的種類多但產生量較少，故將含量較高且差異變化較明顯的兩種酯由表4 列出，可以看出，紅曲霉Q3 在黃酒釀造中不論是乙酸乙酯還是乳酸乙酯的產生量均高于另外兩株紅曲霉，且乙酸乙酯的產生量均高于其他兩株紅曲霉的2 倍。雖然紅曲霉Q3 的酯化酶活力在3 株菌中不是最高，但在黃酒釀造中，乙酸乙酯及乳酸乙酯的產生量卻是最高的，從乙酸的含量推測可能是紅曲霉Q3 在黃酒釀造中會促進乙酸菌等微生物產生較多的乙酸，同時促進乳酸菌等微生物產生較多的乳酸，進而使得具有酯化能力的紅曲霉Q3 將其分別轉化為相應的酯類物質。雖然紅曲霉Q1 的酯化能力最高，但兩種酯的含量卻較低，可能由于在黃酒釀造中紅曲霉Q1 對各類酯相應的有機酸類物質產生量較少，從而導致后期酯的產生量相對較少。

表4 黃酒中乙酸及兩種相關酯的產生量(mg/L)

3 總結

中溫大曲中篩選出的紅曲霉Q3 培養的紅曲米，不論在糖化力還是產紅曲色素的能力方面都要優于另外兩株紅曲霉Q1 及Q2。3 株紅曲霉在黃酒釀造中，在對總酸的產生量無明顯影響的情況下，

紅曲霉Q3 發酵后的剩余總糖量最低，酒精產量最高，說明其在發酵過程中能更好的利用原料，提高酒精含量，同時也可在發酵中通過抑制高級醇的生成途徑或以其為碳源滿足自身生長增殖，從而使得產生的高級醇含量要低于其他兩株紅曲霉。乙酸乙酯及乳酸乙酯作為黃酒中重要的風味物質，在黃酒的風格方面影響很大。3 株紅曲霉中紅曲霉Q1的酯化酶活力最高，但在黃酒發酵中產生的乙酸乙酯及乳酸乙酯的含量卻不是最高。而紅曲霉Q3 產生的乙酸乙酯及乳酸乙酯的含量最高，說明紅曲霉Q3 能夠提高黃酒液態發酵中的酯化能力。而從紅曲霉Q3 產生較高的乙酸含量推測，可能是紅曲霉Q3 會促進乙酸菌等微生物產生乙酸，亦可促進乳酸菌等微生物產生乳酸，使得乙酸乙酯及乳酸乙酯的前體物質產生量較多，進而導致其相應酯的含量增高。因此，黃酒釀造中的中溫大曲中初篩選出的紅曲霉Q3 在提高原料利用率，提高酒精含量，改進產品風格等方面有很好的應用前景。