清香型白酒酒曲中核心真菌發酵特性的研究

張 敏，張錦華

（山西大學生命科學學院，山西太原 030006）

中國白酒有著悠久的歷史，釀酒和微生物的代謝活動息息相關，酒曲中含有大量的微生物菌株，使其具有糖化、發酵和生香的功能，霉菌中的糖化酶可以糖化糧食原料中的還原糖，為酵母的生長和發酵提供能源物質，酵母通過發酵可以產生乙醇和有特殊香氣成分的酯類。

在各種指標中，糖化、酯化和醇化的能力直接反映了白酒生產的能力，是判斷曲的質量的重要指標[1]，對于現實釀造生產也具有指導意義。清香型酒曲中也含有多種真菌，如產乙醇酵母和產酯酵母，其中霉菌也具有高度糖化力。生長曲線反映了酵母在培養過程中的生長和繁殖，是了解所用的菌株和后期發酵培養的生理指標。目前，有許多關于用分光光度法測定酵母生長曲線的研究[2]，而霉菌會形成較大的菌絲體，常用的方法是菌絲干重[3-4]。細胞中的糖化酶可以將淀粉水解成葡萄糖，其通過微生物發酵來產生乙醇[5]。糖化力是曲的質量控制的主要指標，準確快速地確定糖化力對于制曲生產質量具有重要意義[6]。采用最新國標中的直接滴定法測定還原糖的含量，滴定終點為無色，改善了舊方法中磚紅色終點難以準確判斷和控制的缺點。

酵母在白酒釀造過程中對香味物質的形成起著重要作用[7]。釀酒酵母是曲的主要酵母，它在發酵過程中首先利用葡萄糖代謝生成乙醇和乙酸，然后在酵母細胞內酯酶的作用下產生乙酸乙酯[8]。酯化能力主要發生在早期[9]，而乙酸乙酯是清香型白酒中最重要的物質之一[10]，也是清香型白酒香氣的主要成分，其含量越高，香味就越好[11]。氣相色譜法可快速準確地檢測樣品中乙醇和乙酸乙酯的含量。

對清香型白酒的酒曲中核心真菌菌株的發酵特性進行了初步研究，為優化釀酒廠的生產工藝，提高酒曲的質量，生產更優質的清香型白酒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料和試劑

材料：清香型白酒核心菌株（均取自山西省祁縣某酒廠）。霉菌：紅曲霉（Monascus purpureus Went）；11 號（Aspergillus awamori）；根 霉（Rhizopus）。酵母：白地霉（Geotrichum candidum）；擬內孢 霉 酵 母（Endomycopsis）；Kyle（Saccharomyces cerevisiae）；3077（Wickerhamomyces anomalus），3091（Wickerhamomyces anomalus），wind-2（Wickerhamomyces anomalus）。

培養基（均于121 ℃高壓滅菌20 min，試劑均為分析純）：

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（Potato Dextrose Agar Medium，PDA 培養基）：馬鈴薯（去皮并切塊）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，自然pH值。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD 培養基）：葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1000 mL，自然pH值。

酵母浸出粉胨可溶性淀粉培養基（Yeast Extract Peptone Soluble Starch Medium，YPS 液體培養基）：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，可溶性淀粉20 g[12]，蒸餾水1000 mL，自然pH值。

生長培養基：葡萄糖20 g，硫酸銨5 g，磷酸二氫鉀1 g，酵母粉0.5 g，MgSO4·7H2O 5 g[7]，蒸餾水1000 mL，自然pH值；

糖化培養基：可溶性淀粉20 g，硫酸銨5 g，磷酸二氫鉀1 g，酵母粉0.5 g，MgSO4·7H2O 5 g[7]，蒸餾水1000 mL，自然pH值。

試劑及耗材：酵母DNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒，Omega Bio-Tek，中國技術支持中心；引物ITS4,ITS5、6 × Loading Buffer，上海生物工程生物技 術 有限 公 司；Marker，λ DNA/hand III、100 bp Marker、2× Taq PCR Mastermix，北京Real-times 生物科技有限公司；蛋白酶K、溶菌酶瓊脂糖G-10、I型核酸染色劑、二巰基乙醇等，上海生物工程生物技術有限公司。

1.1.2 儀器與設備

JA1203N 電子天平，上海恒平有限公司；LDX-75KB 電熱恒溫培養箱，北京市六一儀器廠；HRHPY-300 恒溫培養搖床，青島海爾特種冰箱柜有限公司；UV-5100 紫外分光光度計，METASH 上海元析儀器有限公司；DYY-6C 雙定時電泳凝膠儀，北京六一生物科技有限公司；DY-8C 旋渦振蕩儀，蘇州凈化設備有限公司；BIO RAD TIOOTM PCR 熱循環儀，新加坡制造；SC-3614 ZONKIA 低速離心機，安徽中科Zonkia 科學儀器有限公司；BioRad 全能成像分析系統，哈爾濱德遠科技開發有限公司；2010 ATF 氣相色譜儀，230V Shimadzu Corporation（日本島津）。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態學和分子生物學鑒定

對其中幾株未知菌株進行測序和鑒定[11，13-14]。將菌株接種到PDA 培養基中，觀察各菌株形態并記錄。待生長狀態良好，用接菌環將菌株接種到YPD 液體培養基中，制備種子液，在28 ℃，120 r/min恒溫搖床中振蕩約20 h，當酵母在YPD培養基中于600 nm 處的OD 值達到約1 h，用酵母DNA 試劑盒提取基因組，再用0.7%瓊脂糖凝膠進行核酸電泳（樣品，5 μL；Marker：λDNA/handIII，5 μL；6×Loading buffer，2 μL）。然后以基因組作為模板進行聚合酶鏈式反應（25 μL 體系：引物：ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，5 μL；ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，5 μL；dNTP，Taq DNA 聚合酶的混合物和緩沖液，12.5 μL；dd 水，2.5 μL；模板，1 μL；PCR 反應條件：起始：105 ℃，體系：25 μL；1.94 ℃，5：00；2.94 ℃，0：30；3.55 ℃，0：30；4.72 ℃，1：30；5.轉到步驟2,34×；6.72 ℃，10：00；7.12 ℃，∞）。用1.5%瓊脂糖凝膠進行核酸電泳（樣品，5 μL；標記物：100 bp 標記，5 μL）進行測試。照膠并記錄，然后對PCR 產物進行測序。

1.2.2 菌株生長曲線

酵母生長曲線：將菌株接種到YPD 液體培養基中制備種子液，在28 ℃，120 r/min 的恒溫搖床中振蕩約14 h，以4000 r/min 離心4 min，棄上清液，加入無菌水懸浮細胞，并調節菌懸液濃度，直至OD 600 nm 值相同。吸取1 mL 菌懸液注入含有100 mL 生長培養基的250 mL 錐形瓶中，然后每隔2 h 測量OD 600 nm[2，15-17]根據相關研究，白地霉應在OD 660 nm處進行測定[18]。

霉菌的生長曲線：向在PDA 培養基上生長的霉菌中加入40 mL 無菌水，涂布并過濾制備孢子懸浮液。吸取2 mL 懸浮液注入含有100 mL 生長培養基的250 mL 錐形瓶中，在28 ℃，120 r/min 下振蕩。每24 h 取出1 次并過濾，在80 ℃下干燥至恒定。差值法計算菌絲體干重[3，19-20]。

1.2.3 糖化力

制備霉菌孢子懸浮液，將2 mL懸浮液吸入50 mL YPS 液體培養基中，并在28 ℃，120 r/min 搖床培養。每天24 h 取霉菌培養基，加入10 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液，30 ℃水浴1 h，過濾，取10 mL 濾液倒入50 mL 2%可溶性淀粉溶液中，在40 ℃水浴中靜置1 h，加入3 mL 1 M 氫氧化鈉溶液停止反應，再加水定容至100 mL。

將5 mL 樣品，6 mL 斐林試劑，10 mL 水，10 個沸石加入150 mL 錐形瓶中。加熱至沸騰時開始滴定。當最后一滴滴下時，溶液藍色消失并變為無色或淡黃色，即為終點。此過程在3 min 內完成。進行預滴定，并設置空白對照，用蒸餾水替換酶溶液。用標準葡萄糖溶液滴定測定還原糖含量，滴定法參照國家標準[12，21]。

糖化酶活性的定義：在40 ℃，pH4.6 的條件下，水解1 mL 可溶性淀粉溶液1 h 所需的酶量被稱為酶活性的一個單位，以U/mL表示[22]。

1.2.4 產酒力

挑取酵母并將其接種于含有50 mL YPD 液體培養基的100 mL 錐形瓶中，在28 ℃，120 r/min搖動20 h，以4000 r/min離心4 min，然后用無菌水懸浮細胞，并將所有菌株的OD 值調整為2。吸取1 mL懸浮液接種到含有50 mL YPD 培養基的100 mL 錐形瓶中，在28 ℃下靜置培養。每24 h 取出樣品用pH 計測量酸度值并蒸餾，收集等量的濾液，通過0.22 μm 濾膜，并通過氣相色譜檢測。氣相色譜條件：進樣口：220 ℃，色譜柱為SGEAC-20 毛細管柱，（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；起始柱溫為32 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至60 ℃；載氣為高純氮氣（純度為99.999%）；檢測器溫度為220 ℃，氫氣流速為30 mL/min，空氣流速為350 mL/min，拖尾速度為30 mL/min，分流比為30∶1；注射量為1 μL[13-14，23]。

1.2.5 酯化力

制備懸浮液，接種于上述YPD 液體培養基中，每24 h取出培養液，加入100 mL 60%乙醇溶液，蒸餾后收集75 mL 餾分，用氣相色譜法測定餾液[24]，色譜條件與上述相同。

1.2.6 數據處理

測序結果用MEGA5 軟件分析，建立系統發育樹，得到鑒定結果。

生長曲線：實驗數據由origin 9.1 軟件分析，取平均值為顯示結果。

糖化力：在液體培養基中培養4 種真菌后，提取懸浮液中的糖化酶并測量活性。樣品中還原糖通過如下公式計算[25-26]：

式中：X：樣品中葡糖淀粉酶活性，U/mg；V：滴定空白樣品時所用的標準葡萄糖溶液的消耗量，mL；V0：滴定樣品時消耗的標準葡萄糖溶液的消耗量，mL；1：每毫升標準葡萄糖溶液中含有的葡萄糖量，mg/mL；100/5：糖化溶液的總體積與用于滴定的糖化溶液的體積的比率；60/10：比率糖化酶溶液的總體積與糖化酶溶液的體積相對應；50：真菌懸浮液的體積，mL。

產酒力和酯化力：用氣相色譜法檢測不同濃度梯度的樣品，以峰面積為橫坐標，濃度為縱坐標，繪制標準曲線。乙酸乙酯趨勢線公式：y=2E-6x +0.0028，R2=0.9997。使用相同的方法，繪制乙醇濃度和峰面積的標準曲線：y=1E-5x-0.0727，R2=0.9994。將樣品的峰面積值代入公式，計算樣品濃度值。

2 結果與分析

2.1 菌株形態和分子生物學特征

圖1 是在PDA 固體培養基上于28 ℃條件下生長3～5 d 的真菌菌落形態圖片。菌株形態特征見表1。

2.2 分子生物學鑒定

使用分子生物學技術進一步鑒定未知菌株。如圖2 所示，提取酵母基因組并進行PCR 反應，對PCR產物進行核酸凝膠電泳。在凝膠圖中，泳道M：100 bp marker，泳道1，2：Kyle，片段大小約800 bp，泳道3，4：3091，泳道5，6：Wind-2，泳道7，8：3077，片段大小均約為600 bp。

圖1 真菌形態學

圖2 Kyle、3091、Wind-2,3077的PCR產物凝膠圖

表1 菌株形態特征

圖3 Kyle、3091、Wind-2、3077的系統發育樹

系統發育樹分析：保留測序結果中可靠的序列，通過NCBI進行比較，獲得具有更高同源性的已知分類群，然后選取并使用這些序列通過Mega.5軟件構建系統發育樹[7]。如圖3 所示，經過比較，kyle 和釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeculture CBS：7764（KY105065.1）之間的相似性高達95%，因此它可能被鑒定為釀酒酵母，而3077,3091 和wind-2 與異常威克漢姆酵母的相似性高達99%，因此它們具有高度的同源性。菌種11 號由南昌科昌生物技術有限公司鑒定，與泡盛曲霉具有高度同源性。

2.3 菌株的生長曲線

圖4 顯示酵母3077、3091、Kyle、Wind-2、Geotrichum candidun、Endomycopsis在600 nm 處的OD值，而白地霉在660 nm 處測量。延滯期為0～6 h，指數生長期為6～30 h，穩定期為30 h。在細胞生長期間培養基中同時含有活細胞和死細胞，以及未使用的培養基和代謝物。因此，培養液的吸光度不能反映衰退情況[27]。

圖4 酵母菌的生長曲線

計算抽濾前濾紙的干重與抽濾后濾紙和菌絲體的總干重之間的差值。在圖5 中，霉菌細胞干重隨時間而變化，其趨勢先增加后減小。11號和紅曲霉菌絲體的干重在第4 天達到最大值，而根霉菌的菌絲干重在第3天達到最大值。

2.4 菌株的糖化力

圖5 霉菌生長曲線

圖6 顯示了3 種不同霉菌的葡萄糖淀粉酶活性隨時間的變化趨勢，隨著時間的延長，均出現先增加而后下降的趨勢。紅曲霉在開始時生長緩慢，然后降低，葡萄糖淀粉酶活性達到最大值，第5 天達到5.76 U/mL;而根霉的最大葡萄糖淀粉酶活性在第3天為7.68 U/mL，11號為6.94 U/mL。

圖6 霉菌糖化力

2.5 酵母的產酒能力和酯化能力

圖7 是6 種酵母的乙酸乙酯產量的變化曲線。不同酵母在不同的發酵階段表現出不同的產酯特性。在第3 天，3077、白地霉和Wind-2 的乙酸乙酯含量分別達到最高值0.178 mg/mL、0.029 mg/mL 和0.558 mg/mL；在第4天，3091，Kyle和擬內孢霉的乙酸乙酯含量分別達到最高值0.144 mg/mL，0.16 mg/mL和0.705 mg/mL。在發酵期內，菌株擬內孢霉表現出較高的合成乙酸乙酯的能力，乙酸乙酯產量明顯高于其他酵母，是清香型白酒中主要的產酯酵母。

圖7 酵母酯化能力

圖8 顯示6 株酵母合成乙醇產量的變化。隨著時間的推移，3077、Endomycopsis、Kyle 和Wind-2 的乙醇產量逐漸減少，第1 天的最大含量分別為17.18 mg/mL、17.43 mg/mL、19.27 mg/mL 和27.05 mg/mL。3091 和白地霉的乙醇含量呈現先增加后減少的趨勢，第4 天最高分別為8.78 mg/mL 和40.72 mg/mL。在實驗測定的5 d 發酵時間內，白地霉乙醇含量最高，顯著高于其他5 株酵母，表現出優異的產酒能力。

圖8 酵母產酒力

3 結論

通過形態學和分子生物學鑒定，確定了核心菌株中幾株未知菌株，分別屬于釀酒酵母，異常維克漢遜酵母和泡盛曲霉。

在測量了菌株的糖化能力后，我們發現在這些真菌中，根霉具有最強的糖化力，最強的葡萄糖淀粉酶活性為7.68 U/mL，而糖化能力最弱的則是擬內孢霉酵母酵母，為3.175 U/mL。

在這些酵母中，結果顯示具有最強酯化力的酵母是擬內孢霉酵母，乙酸乙酯產量為0.705mg/mL；其次是Wind-2，含量為0.558 mg/mL；乙酸乙酯的最低產量為白地霉，0.029 mg/mL，相反，產乙醇的能力最強，最高含量為40.72 mg/mL，產酒精能力最弱的菌株為3091，含量8.78 mg/mL。實驗結果為各核心菌種在酒曲中的靈活運用及清香型白酒的釀造工藝的優化提供了理論依據。