高通量測序分析原香型白酒高溫大曲的細菌群落

楊 旭 ，馬歌麗，王光路，胡曉龍，宋麗麗，張志平，張治剛，王永亮

（1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南鄭州 450001；2.鄭州市代謝工程和系統生物學重點實驗室，河南鄭州 450001；3.賈湖酒業集團有限責任公司，河南漯河 462400）

大曲作為一種重要的發酵劑和專用原料，對中國白酒的品質至關重要[1]。眾所周知，大曲中的豐富酶系和各種微生物是原料中大分子物質水解和代謝的必要條件。此外，大曲還為白酒釀造提供了大量的風味物質和前體物質以及有益的代謝產物。

大曲是在開放環境下自然發酵生產的。生產模式包括簡單的手工制曲和大規模的工業制曲。到目前為止，傳統大曲生產無論采用何種模式，都主要依靠熟練技術人員對工藝參數的調節，其中大曲中微生物主要來自原料和周圍環境。近20 年來，現代分子生物學方法被用來研究醬香、濃香、清香等不同類型白酒大曲的微生物群落。例如，在上述3 種香型白酒大曲中，乳桿菌屬均占優勢，而芽孢桿菌屬在濃香和醬香大曲中為優勢菌群[2]。扣囊復膜孢酵母和橫梗霉在清香和濃香型白酒大曲中占優勢，而疏棉狀嗜熱絲孢菌主要出現在醬香型白酒大曲中[3]。不同類型大曲微生物群落的差異也與環境條件有關。例如，水分和酸度脅迫導致了嗜熱微生物結構的轉變[4]。大曲生產過程中的溫度也是微生物群落組成的重要因素[5]。

目前關于北方不同香型白酒（如原香型）大曲中微生物相關的研究較少。賈湖酒業集團有限責任公司地處我國北部河南省漯河市，通過改進生產工藝，獨創生產出的原香型白酒具有“口感綿柔，醇香四溢”的風格特點。

本研究以賈湖酒業集團有限責任公司所生產的原香型白酒高溫大曲為樣品，以南方高溫大曲為對照，比較研究了高溫大曲的理化性質和細菌種類的不同，以期從細菌層面解析南北方白酒風格差異的可能形成原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用高溫大曲原料是由河南漯河賈湖酒業集團有限責任公司提供的原香型白酒高溫成品大曲（北方大曲，簡寫JH）和對照大曲（南方大曲，簡寫MT）。原料大曲分別粉碎后迅速置于-20 ℃下保藏備用。

1.2 儀器與設備

分光光度計（Beckman Coulter）；電熱恒溫鼓風干燥箱、生化培養箱、電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司），超凈工作臺（蘇州凈化有限公司）；PCR 儀器（Eppendorf有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 大曲水分含量測定

將兩個干凈的培養皿在100～105 ℃的恒溫干燥箱中烘干，當烘干至恒重時記作W0，在天平上連同培養皿稱取大約10 g 的預先研磨好的大曲樣品，記作W1，將培養皿在100～105 ℃干燥箱中烘干，記下重量，再在干燥箱中烘干至恒重記下重量為W2。

1.3.2 大曲酸度測定

用天平稱取10 g 的粉末狀大曲樣品于燒杯中，加水100 mL，常溫下放置0.5 h，用脫脂棉對樣液過濾。將大曲浸出液用移液槍吸取1 mL 到一個干凈的錐形瓶中，由于受浸出液顏色的影響需要加入9 mL 的水對其進行稀釋，加酚酞2～3 滴，搖勻，用氫氧化鈉溶液滴定，當溶液的顏色變得微紅，并且10 s內顏色不褪去就是滴定終點[6]。

式中：C——氫氧化鈉溶液濃度（mol/L），V——氫氧化鈉溶液體積（mL）。

1.3.3 大曲蛋白酶活力測定

將在40 ℃預熱的大曲浸出液1 mL 加入1 mL酪蛋白溶液（2%），保溫10 min，加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸溶液終止酶解反應后離心；取1 mL 上清液分別加入5 mL 0.4 mol/L 碳酸鈉溶液、1 mL 福林試劑，在40 ℃下保溫20 min，測定680 nm波長處的OD值。

1.3.4 高通量測序方法

使用DNA 提取試劑盒從樣本中提取DNA，使用Qubit? dsDNA HS Assay Kit 檢 測DNA 濃 度。以20～30 ng DNA 為模板，使用金唯智設計的一系列PCR 引物擴增原核生物16S rDNA 上包括V3 及V4 的2 個高度可變區。采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC ”序列的下游引物擴增V3 和V4 區。另外，通過PCR 向16S rDNA 的PCR 產物末端加上帶有Index 的接頭，以便進行NGS 測序。PCR 反應參數：預變性參數94 ℃3 min × 1，變性參數94 ℃5 s，退火參數57 ℃90 s，延伸72 ℃10 s，終延伸參數72 ℃5 min，共進行24 個循環。PCR 擴增結果鑒定：PCR 產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。委托蘇州金唯智生物科技有限公司采用按Illumina MiSeq(Illumina,San Diego,CA,USA)儀器使用說明書進行PE250/PE300 雙端測序，由MiSeq 自帶的MiSeq Control Software(MCS)讀取序列信息。

2 結果與討論

2.1 大曲理化性質分析

衡量大曲樣品的理化性質，可以用水分、酸度和蛋白酶活力等理化成分指標進行比較，結果如表1所示。根據制曲車間大曲質量檢驗標準的相關規定，大曲中的水分含量不能超過13%[7]，該條件下大部分微生物都停止了生長、繁殖和代謝。大曲在添加到原料中發酵生產白酒時，處于休眠狀態的微生物重新復蘇，參與糧食的糖化、發酵、酯化等過程。由表1 可看出，大曲JH 和MT 樣品中水分都達到要求，均為合格大曲。大曲酸度是評定大曲質量的重要指標，酸度主要是由產酸微生物在大曲中進行有機酸代謝形成。結果表明，大曲JH 的酸度低于大曲MT，說明大曲JH 中產酸微生物的數量少于大曲MT（后文中高通量分析結果也證實該結論），同時也歸因于大曲JH中蛋白酶活力更高[8]。

2.2 大曲細菌組成和多樣性分析

大曲樣品運用PCR 方法擴增16S rRNA 的V3和V4 區進行高通量測序，進行細菌多樣性分析，結果如表2。樣本文庫覆蓋率（Coverage 指數）達到1，說明本次測序結果能代表樣本的真實情況，完全能夠反映該區域細菌群落的種類和結構。大曲樣品微生物多樣性指數估計值的結果表明，大曲JH細菌群落多樣性略低于大曲MT，這可能是造成南北方白酒品質差異的原因之一。

大曲樣品的細菌結構組成（屬水平）如圖1 所示。大曲JH 中優勢細菌為蛋白酶產生菌Virgiba-cillus，其相對豐度達到61.01%，而大曲MT 中蛋白酶產生菌Virgibacillus相對豐度只有17.44%，該結果同表1 中蛋白酶活力測定結果相對應，說明大曲JH 由于蛋白酶產生菌為優勢菌具有較好降解原料蛋白質的能力。蛋白酶能分解原料中蛋白質產生各種氨基酸，參與美拉德反應有利于促進大曲風味前體物質的形成，形成濃厚的曲香。

高溫放線菌屬Kroppenstedtia在大曲JH中相對豐度達到了17.66%，高于大曲MT的1.08%。耐熱高溫細菌的存在主要由于高溫大曲特殊的工藝條件有關，大曲可維持在一個高溫高濕的環境，從而形成獨特的、具有特殊香氣的高溫大曲[9]。

另外，由表2 結果可知，大曲JH 的微生物多樣性低于大曲MT，在細菌結構上主要表現在大曲MT 中還含有適量不動細菌屬Acinetobacter（相對豐度3.98%）、酵母屬Saccharopolyspora（相對豐度2.61%）、芽孢桿菌屬Scopulibacillus（相對豐度0.65%）和鏈霉菌屬Streptomyces（相對豐度0.69%），魏斯氏菌屬Weissella和乳桿菌屬Lactobacillus也均被檢測出。這些多樣性細菌在大曲JH中均未檢測到。結果表明，南北方大曲同屬于高溫細菌大曲，但細菌的多樣性不同，南方大曲中細菌種類明顯多于北方大曲，該結果同印璇的研究結果一致[10]。蔣紅軍[11]研究結果表明，細菌多樣性主要成因是環境因素，由于氣候條件的不同，南方釀造廠區因地理位置的特殊性，空氣流動性較北方差，白酒車間附近的微生物種群經多年篩選馴化，環境中的有益于釀酒的微生物區系基本保持一個動態平衡。

3 結論

本研究對北方高溫大曲JH 和南方高溫大曲MT 培制過程中的細菌變化情況進行了分析，并對大曲的相關理化指標水分、酸度和蛋白酶活力進行了測定，簡單分析了大曲中細菌群落結構組成的不同及酸度和蛋白酶活力之間的相互聯系，得出南北方高溫大曲在理化指標和細菌組成之間的差別，是造成南北方白酒品質差異的主要原因之一。

從分析結果來看，北方高溫大曲JH 中優勢菌為蛋白酶產生菌Virgibacillus，相對豐度高于南方大曲MT，造成大曲JH 蛋白酶活力較高，有利于原料蛋白質的降解產生多種氨基酸參與美拉德反應促進大曲風味前體物質的形成，形成濃厚的曲香。高溫放線菌屬Kroppenstedtia在大曲JH中相對豐度達到了17.66%，高于大曲MT的1.08%。

大曲JH 微生物多樣性低于大曲MT，如大曲MT 中不動細菌屬Acinetobacter、酵母屬Saccharopolyspora、芽孢桿菌屬Scopulibacillus、鏈霉菌屬Streptomyces、魏斯氏菌屬Weissella和乳桿菌屬Lactobacillus在大曲JH 中均未檢測到。這可能是由于南北方氣候的差異，使得南方大曲中釀酒微生物組成上更加豐富，因此有南方適于釀造醬酒的說法，而北方大曲中細菌組成稍微單一，也是能夠釀造原香型白酒的原因之一。以上結果能夠為揭示南北方白酒品質差異和大曲的生產工藝改良提供理論依據。