白酒中氨基甲酸乙酯檢測方法比較

尤小龍，胡 峰，鐘 航，陳明學，程平言，鐘方達

（貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司，貴州習水 564622）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）又名尿烷（Urethane），是一種在食品發酵和儲藏過程中會自然生成的污染物[1-2]，據動物實驗都證明了其對肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病有潛在致癌風險[3-4]。大部分發酵食品均存在EC 的污染[5-6]，食品添加劑聯合專家委員會評估從酒精飲料中的EC 平均攝入量是80 ng/kg 體重·d，雖未超過致癌較低置信區間基準劑量的0.3 mg/kg 體重·d，但酒精飲料中EC 含量已經足夠引起相關部門重視[7-8]。2007 年歐洲食品安全管理局的報告，人類在食物中攝入的EC 約17 ng/kg 體重·d，如飲酒則可達到65 ng/kg 體重·d。目前，真菌毒素和EC 都被視為食品安全中的重要問題[9]，我國暫時參照加拿大的國際限量標準對EC進行控制，尚未制定有關EC的強制性標準[10]。

白酒是我國傳統的蒸餾酒，也是我國特有的傳統酒種，具有獨特的工藝和風格，以其優異的色、香、味、格受到廣大飲用者的喜愛，白酒中氨基甲酸乙酯檢測準確性直接關乎消費者身體健康[11]。雖然我國目前未制定白酒中有關氨基甲酸乙酯的強制性標準，但是氨基甲酸乙酯的問題已經引起了廠家和消費者的普遍關注。白酒的傳統工藝源遠流長，釀造過程中使用多種原料輔料，其中部分含氮化合物會生成氨基甲酸乙酯前體物質繼而被微生物轉化為氨基甲酸乙酯，進入白酒中會造成潛在的食品安全風險[12-14]，因此選取采用靈敏度高、檢測限低、實用性強的檢測方法對酒企以及食品安全部門都異常重要。早期的用于檢測EC 的氣相色譜分析法與傅里葉變換紅外光譜法穩定性較差且檢出限較高[15]，本研究建立、使用穩定性和檢出限均較為理想的HPLC 與GC-MS 檢測分析方法，對兩種方法的優劣進行對比，明確兩種方法的準確性和適用范圍，期望對我國氨基甲酸乙酯的相關標準制定提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：本公司白酒產品，兩款。

試劑：EC標準品（CAS：51-79-6，純度99.50%），ChemService 公司；D5-氨基甲酸乙酯（CAS：73962-07-9），ChemService 公司；9-羥基占噸，分析純；無水硫酸鈉，分析純；氯化鈉，分析純；正己烷，色譜純；乙醚，色譜純；乙腈，色譜純；甲醇，色譜純。

儀器設備：Agilent高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Agilent7890A-7000B 三重四級桿串聯氣質聯用儀，美國安捷倫公司；無水硫酸鈉小柱（2 g，6 mL），AN-PEL Laboratory Technology 公 司；OA-SYS 氮吹儀，上海安譜公司。

1.2 高效液相色譜（HPLC）方法

1.2.1 樣品處理

準確吸取1.0 mL 酒樣于試管中，加入100 μL 1.5 mol/L 鹽酸溶液、600 μL 0.02 mol/L 9-羥基占噸溶液，混勻，室溫下避光衍生60 min，經0.22 μm 有機濾膜過濾，濾液用于液相色譜測定。

1.2.2 色譜條件

（1）色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）或等效色譜柱。

（2）柱溫：30 ℃。

（3）激發波長：233 nm，發射波長：600 nm。

（4）流速：0.8 mL/min。

（5）進樣體積：20 μL。

（6）高效液相色譜洗脫條件（表1）。

表1 梯度洗脫程序

1.2.3 標準溶液配制

準確稱取0.0100 g 氨基甲酸乙酯，用無水乙醇溶解并定容至10 mL 混勻。0～4 ℃下保存。準確吸取氨基甲酸乙酯標準儲備液，用40%乙醇溶液依次配制成20.00 μg/L、50.00 μg/L、100.00 μg/L、200.00 μg/L、400.00 μg/L的系列標準工作溶液。

1.2.4 標準曲線繪制

將各個濃度的標準曲線工作溶液依次進行HPLC 分析，對峰面積和濃度比繪制標準曲線得出回歸方程與相關系數。

1.3 氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）法

1.3.1 樣品處理

準確稱取2 g（精確至0.01 g）酒樣，加入100 μL 2 μg/mL D5-氨基甲酸乙酯內標儲備液，搖勻后加樣到固相萃取柱上，抽真空，讓試樣滲入到固相萃取柱中，吸附10 min 后用15 mL 正己烷淋洗除雜，再用15 mL 5%乙酸乙酯/乙醚（v∶v）溶液洗脫并經過無水硫酸鈉的萃取柱上脫水，收集于10 mL 離心管中，在室溫下氮吹至0.4 mL 左右，用甲醇定容至1.0 mL，經有機相濾膜過濾后進樣進行GC-MS分析。

1.3.2 儀器分析條件

7890B/7000C 三重四級桿氣質聯用儀，進樣口溫度220 ℃；色譜柱DB-INNOWAX 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），初始溫度50 ℃，保持1 min，以8 ℃/min 升至180 ℃，程序完成后240 ℃保持5 min；不分流進樣，進樣量1 μL；載氣為高純（≥99.999%）氦氣（He），流速1 mL/min；電離方式：電子電離（electronionization，EI）源，離子源溫度230 ℃。氨基甲酸乙酯監測離子（m/z）：44、62、74；D5-氨基甲酸乙酯監測離子（m/z）：64、76。

1.3.3 標準溶液配制

準確稱取0.0100 g 氨基甲酸乙酯標品，用甲醇溶解并定容至10 mL 混勻。配制為1 mg/mL 的氨基甲酸乙酯標準儲備液。

準確稱取10 mg D5-氨基甲酸乙酯標準品，用甲醇定容至10 mL，配制為1 mg/mL D5-氨基甲酸乙酯貯備液；吸取0.1 mL 的1 mg/mL D5-氨基甲酸乙酯貯備液，用甲醇定容至50 mL 制得2 μg/mL 的D5-氨基甲酸乙酯儲備液。

分別吸取0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL 的1 mg/mL 的氨基甲酸乙酯標準儲備液，加入1 mL 2 μg/mL的D5-氨基甲酸乙酯儲備液，用乙酸乙酯定容至10 mL，配制成質量濃度為10 μg/L、25 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L 的氨基甲酸乙酯標準系列溶液（內含200 μg/L的D5-氨基甲酸乙酯）。

1.3.4 標準曲線繪制

將10 μg/L、25 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L 的氨基甲酸乙酯標準系列溶液依次進行GC-MS 分析，以氨基甲酸乙酯濃度為橫坐標，以相應濃度的峰面積與內標峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線。

2 結果與討論

2.1 儀器檢測圖譜觀察

按照相應的條件進行實驗，其中標樣的HPLC圖譜見圖1，標樣的GC-MS 總離子流圖譜和質譜圖見圖2、圖3、圖4。由圖3、圖4 可知，兩臺HPLC與GC-MS 儀器對樣品的響應均較為良好，可以滿足實驗要求。

圖1 氨基甲酸乙酯標準液液相色譜圖

圖2 氨基甲酸乙酯及D5-氨基甲酸乙酯內標總離子流圖

圖3 氨基甲酸乙酯質譜圖

2.2 線性關系及檢出限

按照1.2.4 和1.3.4 的方法進行標準曲線的繪制，結果見圖5、圖6，其中Y 軸為峰面積，X 軸為濃度。

由圖5 可知，HPLC 回歸方程為y=0.0036x+0.0036，相關系數R2=0.9998，該標準曲線的線性關系較好，滿足分析的要求。按信噪比S/N=3 推算，檢出限為4.0 μg/L。

圖4 D5-氨基甲酸乙酯內標質譜圖

圖5 液相色譜標準工作曲線

圖6 氣相色譜-質譜聯用標準工作曲線

由圖6 可知，GC-MS 回歸方程為y=0.0049x+0.0113，相關系數R2=0.9998，該標準曲線的線性關系也較好，滿足分析的要求。按信噪比S/N=3 推算，檢出限為1.3 μg/L。

2.3 精密度與回收率驗證

每個樣品進行加標測定，取對照酒樣DZ 5 mL，進行加標，加標量分別為50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L，加標后的樣品進行兩種方法的檢測分析，每個樣品按照1.2.1 和1.3.1 中樣品處理方法重復處理4 次，進行平行試驗，并根據結果計算其回收率與相對標準偏差，結果見表2 和表3。結果顯示，HPLC 檢測回收率在84.9%～105.1%之間，RSD 小于6.84%；GC-MS 檢測回收率在95.3%～104.7%之間，RSD 小于4.26%。兩種方法的準確性和重復性達到了實驗要求，可以較為精準的檢測出樣品中的EC含量。

表2 HPLC測定加標樣品結果

表3 GC-MS測定加標樣品

2.4 實際樣品的測定結果

取市購酒樣5 種，每個酒樣進行3 次測定，測定結果取平均值，測量結果見表4。由表4 可見，5 個酒樣中均檢測出了氨基甲酸乙酯，但是含量均未超過現行的加拿大、日本、法國等國針對蒸餾酒的限量標準150 μg/L。HPLC 平行3 次進樣的結果RSD小于6.08%，GC-MS結果RSD小于3.56%。

表4 5種樣品中氨基甲酸乙酯檢測值

對兩種檢測方法的結果進行比較，用同一樣品的結果差絕對值除以結果的平均值，同一個樣品使用兩種方法所測的樣品結果偏差也均小于4.31%，兩種方法檢測結果差較小，再次證明兩種方法的科學性和準確性。

2.5 方法小結

實驗使用的2 個酒樣中氨基甲酸乙酯分析方法，HPLC 回歸方程為y=0.0036x+0.0036，相關系數R2=0.9998，檢出限為4.0 μg/L，回收率在84.9%～105.1%之間，RSD 小于6.84%；GC-MS 回歸方程為y=0.0049x+0.0113，相關系數R2=0.9998，檢出限為1.3 μg/L，GC-MS檢測回收率在95.3%～104.7%之間，RSD 小于4.26%。兩種方法的準確性和重復性達到了實驗要求，可以較為精準的檢測出樣品中的EC含量。

應用HPLC 和GC-MS 方法對市購的5 種酒樣進行檢測，得到了較為精確的測量結果，兩種方法檢測結果偏差均小于4.31%，方法的科學性和準確性得到證明。

2.6 方法對比

本研究應用兩種方法進行氨基甲酸乙酯的測量，前文已經就兩種方法的標準曲線、相關系數、回收率、RSD 值等測量結果的數據進行了計算和說明，將樣品處理時間與進樣時間統計后與其他因素一起列表進行比較，比較結果見表5。分析兩種方法標準曲線，其相關系數皆為0.9998，都表現出了較好的線性關系；從檢出限來看，HPLC 要比GCMS 大3.2 μg/L，這標示著GC-MS 法的應用范圍更廣，其也可用于檢測EC含量較低的樣品；分析兩種方法的回收率和RSD 值，可以發現GC-MS 的回收率比HPLC要高6%左右，最大RSD值要低2.58%，故相對而言GC-MS方法的精確性和穩定性要略高于HPLC 方法。前處理時間和進樣時間對比，GCMS 在總時間上要比HPLC 法縮短35 min，但是HPLC 法的前處理過程中有60 min 的等待時間，而且就前處理步驟而言HPLC 相對簡單，總體上HPLC 法前處理操作更方便省事，但是如果樣品數量龐大而需要結果的時間緊迫時，選用GC-MS 法可以更快地完成分析檢測。

表5 HPLC與GC-MS方法實驗參數對比

3 結論

本研究建立了HPLC 與GC-MS 兩種白酒樣品中EC 含量的檢測方法，其中HPLC 法檢出限為4.0 μg/L，回收率在84.9%～105.1%之間，RSD 小于6.84%；氣相色譜-質譜檢出限為1.3 μg/L，GCMS 檢測回收率在95.3%～104.7%之間，RSD 小于4.26%。結果顯示，兩種方法的準確性和重復性均符合實驗要求，但通過分析比較HPLC 法前處理操作更為方便，試劑毒性相對較低；但GC-MS方法的精確性和穩定性比HPLC 法更高，檢出限更低，總體處理及進樣時間更短，單位時間內能更快、更精確地對酒樣中氨基甲酸乙酯進行檢測。

通過兩種方法檢測5 種市購酒樣，5 個樣品都檢測出了氨基甲酸乙酯，雖然沒有超過國際標準，但暴露出我國白酒產品中的EC 食品安全隱患，隨著白酒產業的發展與消費者的安全消費意識日益提升，人們對食品中EC 的關注也越來越強。白酒中EC 檢測強制性標準的制定勢在必行，在檢測基礎上的EC 控制方法研究也會成為白酒風險體系工作的重點之一。2017 年全國白酒規模以上酒企實現近6500 億的銷售額，預計未來3～5 年白酒行業將會持續增長，這意味著白酒中EC 的檢測量會更加多、要求更嚴格，選用本文的HPLC 法與GC-MS法都能滿足一般情況下的白酒檢測需求，但在當前乃至未來3～5 年內選用GC-MS 法進行白酒氨基甲酸乙酯的檢測更能滿足相應的檢測需求。