QuEChERS結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定糧谷中16種真菌毒素

王麗娟 ，李 超，陳嘉杰，吳奕萱，楊春艷，安紅梅，柯潤輝

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；2.中國家用電器研究院，北京 100037）

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的小分子有害次級代謝產(chǎn)物[1]，普遍存在于玉米、大米、小麥以及相關(guān)的加工產(chǎn)品中[2]。目前已知有400 多種，其中對人類健康影響巨大的有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素和展青霉素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素等[3-4]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計，每年全球農(nóng)產(chǎn)品污染率高達25%，損失達10 億噸；據(jù)我國國家糧食局統(tǒng)計，每年有3100 萬噸糧食在生產(chǎn)、儲存、運輸?shù)倪^程中受到真菌毒素污染，約占糧食年總產(chǎn)量的6.2%，因此需要對其進行監(jiān)測以控制食物鏈中的霉菌毒素[5-6]。全世界至少100 個國家通過法規(guī)或標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格規(guī)定糧食中主要真菌毒素的限量，并建立了多種用于篩查、確認(rèn)和定量等不同目的的檢測方法對真菌毒素進行監(jiān)控[7]。我國也高度重視食品中真菌毒素污染問題，已明確將其列入重點關(guān)注的污染物質(zhì)[8]。為了更好地加強對糧食中真菌毒素的監(jiān)測，保障人畜健康，開發(fā)快速、高通量、前處理簡單、準(zhǔn)確的真菌毒素檢測方法具有非常重要的意義[9]。

糧谷中真菌毒素經(jīng)典的檢測技術(shù)有薄層色譜法（TIC）[10]、氣相色譜法（GC）[11]、酶聯(lián)免疫吸附法[12]和液相色譜法等[13-14]，這些方法雖然各有優(yōu)點，但可靠性、靈敏度和檢測通量上仍有較大提升空間。近年來，隨著液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS) 技術(shù)的發(fā)展，因其高通量和高靈敏度，在真菌毒素檢測方面的優(yōu)勢越來越明顯[15]。LC-MS/MS 采用選擇性的離子監(jiān)測技術(shù)手段，對檢測的靈敏度和特異性有很大的提高，因此，在處理樣品時可以選擇比傳統(tǒng)方法更簡單、更快速的前處理方法。QuEChERS方法自2003 年提出以來，憑借著其實驗步驟少、操作簡單、對復(fù)雜樣品凈化效率高的優(yōu)勢，在農(nóng)獸殘檢測方面的應(yīng)用日益廣泛[16-17]。樣品中真菌毒素的提取凈化一般是用免疫親和柱或其他的凈化劑進行固相萃取[18]、凝膠固相萃取[19]等，步驟較繁瑣、成本較高。因此，本試驗綜合利用LC-MS/MS 和QuEChERS 方法的優(yōu)勢，在相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，建立了快速、準(zhǔn)確測定糧谷中16種真菌毒素的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大米、小麥、玉米樣品：購自零售超市和商店。

儀器：LCMS-8050 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本Shimadzu 公司，具體配置為LC-20ADXR×2輸液泵，DGU-20A3R 在線脫氣機，SIL-20AXR 自動進樣器，CTO-20AC 柱溫箱，CBM-20A 系統(tǒng)控制器，LCMS-8050 三重四極桿質(zhì)譜儀，LabSolutions Ver.5.91 色譜工作站）；Milli-Q Reference 超純水器（美國Millipore 公司）；超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山超聲儀器有限公司）；Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm,1.7 μm，美國Waters 公司）；0.22 μm尼龍濾膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

試劑及耗材：甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨（HPLC級，Dikma 公司）；黃曲霉素毒素B1、B2、G1、G2、M1、赭曲霉毒素A、T-2 毒素、HT-2 毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3Ac-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15Ac-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇，美國Sigma Aldrich公司，加拿大TRC公司和德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度≥95%。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取16 種生物毒素標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的單標(biāo)儲備液，于-18 ℃下避光保存。用甲醇稀釋并配制中間濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃下避光保存。根據(jù)需要用流動相逐級稀釋，配制成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的樣品粉末5.00 g（精確到0.01 g），置于50 mL 塑料離心管中，加入20 mL 乙腈-水-乙酸（84∶15∶1，v/v），渦旋振蕩3 min，超聲20 min，浸泡過夜；加入4 g 無水MgSO4，1g NaCl，渦旋2 min，9000 r/min 離心10 min。取5 mL 上清液，加入120 mg C18，600 mg MgSO4，渦旋2 min，上清液過0.22 μm濾膜，LC-MS/MS測定。

1.4 檢測條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm，美國Waters公司）。流動相：（A）甲醇/乙腈（v/v∶4/6）和（B）0.1%甲酸水溶液，流速0.30 mL/min；梯度洗脫程序為：0～0.5 min，A 的體積分?jǐn)?shù)為20%；0.5～0.8 min，A的體積分?jǐn)?shù)從20%升至50%，0.8～4.5 min，A的體積分?jǐn)?shù)從50%升至80%，4.5～5.5 min，A 的體積分?jǐn)?shù)從80% 升至90%，5.5～5.6 min，A 的體積分?jǐn)?shù)從90% 降至20%，5.6～7.5 min，A 的體積分?jǐn)?shù)保持20%。柱溫為35 ℃；進樣體積：2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

分析儀器：LCMS-8050；離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正負(fù)離子模式同時掃描；離子源接口電壓：0.5 kV；霧化氣：氮氣3.0 L/min；干燥氣：氮氣10 L/min；碰撞氣：氬氣；DL 溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；駐留時間：11 ms；延遲時間：3 ms；16 種生物毒素標(biāo)準(zhǔn)品MRM參數(shù)：見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇

測定真菌毒素流動相通常由水和有機溶劑（如甲醇、乙腈）等組成，本研究對流動相進行了考察和優(yōu)化。當(dāng)采用乙腈為有機相時，組分“共流出”情況較甲醇嚴(yán)重，而選擇甲醇為有機相時，出峰時間明顯靠后，測定時間延長，且甲醇較乙腈黏度更大，柱壓較高，不利于色譜柱及相關(guān)儀器配件的長久使用，故采用甲醇/乙腈混合溶劑作為有機相，通過實驗發(fā)現(xiàn)，甲醇∶乙腈濃度為4∶6 時，可在較短的時間內(nèi)完成16 種真菌毒素的分離測定。水相通常用緩沖鹽溶液或弱酸性溶液，以增加電離度，提升響應(yīng)值，當(dāng)采用負(fù)離子監(jiān)測模式測定時，在流動相中加入一定量氨水、乙酸銨等適合負(fù)離子模式的鹽，實驗比較了甲酸水溶液、乙酸銨水溶液、氨水溶液作為水相的測定效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用氨水作為水相測定時，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其衍生物在負(fù)離子監(jiān)測模式下雖有較高的響應(yīng)值，但黃曲霉毒素等大部分正離子模式測定的毒素響應(yīng)值較低，無法滿足檢測需要；當(dāng)采用乙酸銨水溶液測定時，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其衍生物響應(yīng)值很低，且乙酸銨作為非揮發(fā)緩沖鹽溶液進入質(zhì)譜，對離子源會造成一定程度的污染；采用甲酸水溶液測定時，可增強正離子監(jiān)測的目標(biāo)化合物的響應(yīng)值，同時，對于負(fù)離子監(jiān)測的化合物同樣可以達到較好的響應(yīng)，進一步試驗比較含0.05%、0.1%、0.2%不同濃度的甲酸對真菌毒素的測定效果，發(fā)現(xiàn)使用含0.1%的甲酸時，靈敏度和分離度均達到最好，最終選擇甲醇∶乙腈（4∶6）、0.1%甲酸水溶液作為流動相。

表1 16種生物毒素的保留時間和質(zhì)譜條件

2.1.2 流速的選擇

在確定了流動相的情況下，對流動相的流速進行了進一步的優(yōu)化。考察了0.2 mL/min、0.3 mL/min、0.4 mL/min 3 個不同流速的測定情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)測定流速為0.2 mL/min，出峰時間靠后，測定時間延長；當(dāng)為0.3 mL/min 時，分離度良好，靈敏度較高；進一步提高流速至0.4 mL/min，測定壓力明顯提高，且響應(yīng)值有了不同程度的下降，這主要是由于流速加大，分析柱的保留能力降低，質(zhì)譜的離子化效率也降低。故最終選擇流速0.3 mL/min。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

分別將配制的質(zhì)量濃度為1 mg/L 的真菌毒素單標(biāo)準(zhǔn)溶液不接色譜柱直接進入質(zhì)譜中進行質(zhì)譜條件優(yōu)化。采用ESI±同時掃描模式進行一級質(zhì)譜分析，確定其準(zhǔn)分子離子，發(fā)現(xiàn)5 種黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A 均可得到[M+H]+分子離子峰，5 種玉米赤霉醇類均可得到[M-H]-分子離子峰，T-2 與HT-2 毒素則得到[M+NH4]+分子離子峰，3 種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇類在[M+H]+和[M-H]-下均有響應(yīng)，考慮到當(dāng)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在負(fù)離子模式下測定時流動相中需加入少量氨水，而氨水會抑制其他真菌毒素的測定，當(dāng)其在正離子模式下測定時，選取甲酸水溶液，16 種真菌毒素均可達到較高的響應(yīng)，故脫氧雪腐鐮刀菌烯醇選取[M+H]+為其準(zhǔn)分子離子，再對母離子進行二級質(zhì)譜掃描，優(yōu)化CE，并選取相對豐度較高且穩(wěn)定的兩個特征離子作為定性、定量離子，經(jīng)儀器自帶的質(zhì)譜參數(shù)自動優(yōu)化程序優(yōu)化。確定16 種真菌毒素的最佳質(zhì)譜條件，各化合物的質(zhì)譜條件見表1。16 種真菌毒素的總離子流圖見圖1。

圖1 16種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 樣品提取與凈化

由于不同種類真菌毒素的理化性質(zhì)差異很大，提取溶劑的選擇是前處理過程中最重要的環(huán)節(jié)，直接影響回收率的高低。目前糧食中多組分真菌毒素的提取主要選擇甲醇、乙腈等有機溶劑與水的混合液作為萃取溶劑。乙腈的提取率高，適用范圍更為廣泛，本實驗選用乙腈作為提取溶劑，對于極性范圍敏感的目標(biāo)毒素提取時，為保證各種真菌毒素的提取效果，需在提取液中添加輔助試劑（乙酸、甲酸等）以增強聯(lián)合提取的效果[22]。實驗比較了乙腈、水以及酸在不同配比條件下的提取效果，發(fā)現(xiàn)乙腈-水-乙酸（84∶15∶1，v/v）作為提取溶劑時，16種真菌毒素的回收率可達到80%以上。

2.3.2 凈化方式選擇

近年來，QuEChERS 前處理技術(shù)廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的分析檢測中，其高效、簡便和綠色的技術(shù)理念逐漸在生物毒素等分析檢測領(lǐng)域得到應(yīng)用[20]。C18凈化劑在前處理領(lǐng)域里有著廣泛的應(yīng)用，其對脂肪和脂類物質(zhì)等非極性干擾物有良好的吸附效果。乙二胺-N-丙基（PSA）硅烷作為一種具有吸附活性的試劑，能夠有效吸附樣品提取液中的脂質(zhì)、糖類等有機化合物，因此在QuEChERS 前處理過程中備受青睞。實驗比較了PSA 和C18分別與無水硫酸鎂組合的凈化效果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入PSA 時，OTA 的回收率顯著下降，而C18和無水硫酸鎂不僅能起到良好的凈化效果，還能得到較高的回收率，最終確定C18和無水硫酸鎂混合填料作為QuEChERS 凈化吸附劑。

2.4 方法學(xué)評價

2.4.1 方法的線性范圍和檢出限

將16 種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)儲備液用空白基質(zhì)提取液分別配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按上文1.4 部分確定的色譜及質(zhì)譜條件進行測定，以各組分定量離子的色譜峰面積對相應(yīng)的質(zhì)量濃度繪制各組分的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，16種真菌毒素的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.995。以信噪比為3 確定方法的檢出限（LOD），以信噪比為10 確定方法的定量限（LOQ）。結(jié)果見表2。

2.4.2 精密度和回收率

分別選取空白小麥、大米、玉米做回收率實驗，用微量移液器向空白樣品中準(zhǔn)確加入一定量的16種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低、中、高3 個濃度水平進行回收率實驗，按1.3 節(jié)所述實驗步驟進行處理和測定，進行6 次重復(fù)實驗，計算其回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，各目標(biāo)物平均回收率在90.6%～106.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8.8%（表3），方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合多殘留分析的要求。

表2 16種真菌毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.5 實際樣品的測定

按所建立的方法對市售共5 批次小麥、5 批次玉米和5 批次大米樣品進行了16 種真菌毒素的篩查，每個樣品重復(fù)測定3 次。除2 批次大米外其他所檢樣品脫氧雪腐鐮刀菌烯醇均有檢出，其含量范圍為25.6～429.3 μg/kg。

表3 糧谷中16種真菌毒素添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

3 結(jié)論

本研究建立了QuEChERS 結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定糧谷中16 種真菌毒素含量的方法，該方法靈敏度高、前處理簡單、分析速度快。對實際樣品的檢測表明，該方法可以滿足糧谷中16種真菌毒素的分析要求，與國標(biāo)方法相比，提高了分析效率，降低了分析成本。適合大批量糧谷樣品中16種真菌毒素的定性定量分析。