紅曲菌在釀酒過程中的生產應用試驗研究

李富強，閆培勛，曹振華，李紹亮，李學思，郭淑平，張祥德

（河南省宋河酒業股份有限公司，河南鹿邑 477265）

紅曲菌是一種腐生真菌，具有典型霉菌的特征，喜暖喜濕，能形成分枝甚繁的菌絲體，呈肉眼可見的絨絮狀，呈紅色、褐色或無色，紅曲菌生活能力較強，在pH3～5 范圍內均能生長，能耐受10%vol 乙醇，能在含25%甘油培養基中生長，能利用葡萄糖、麥芽糖、淀粉、甘油、山梨醇、乳酸等[1]。但其在分類學上又不屬于霉菌，紅曲菌在分類學上屬于真菌界、子囊菌門、真子囊菌綱、散囊菌目、紅菌科[2-3]。目前中科院微生物菌種保藏管理委員會正式收藏保存的紅曲菌有8 種共48 個菌株，常見紅曲菌種類有紅曲紅曲菌(M.anka)、紅色紅曲菌(M.ruber)、紫色紅曲菌(M.purpureus)、煙色紅曲菌(M.fuliginosus)、佛羅里達紅曲菌（M.floridanus）、血紅色紅曲菌（M.sanguineus）、叢毛紅曲菌（M.pilos)、橙色紅曲菌（M.aurantiacus)、血紅紅曲菌（M.sanguineus）和蒼白紅曲菌（M.pallens）等[4-5]。

紅曲菌廣泛分布于自然界中，能產生多種酶：淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、α-葡萄糖苷酶、酯化酶等。紅曲菌能產生紅黃兩系色素如紅曲玉紅胺、紅曲玉紅素、紅曲素、N-葡糖基紅斑胺、N-葡糖基紅曲紅胺、N-戊二酰基紅斑胺等。紅曲菌代謝產物也有桔霉素、莫納可林K、γ-氨基丁酸（GABA）等。

宋河酒業采用老五甑工藝，續米查配料，在不同米查次之間所產原酒質量均有所不同。本實驗以宋河中高溫大曲為實驗材料篩選出1 株紅曲菌，以該株紅曲菌為研究對象生產酯化紅曲，在宋河酒業釀酒生產車間不同米查次添加不同質量的酯化紅曲進行實驗，為以后紅曲菌的生產試驗奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

實驗原輔料：中高溫大曲，來自宋河酒業制曲車間；麩皮，市售優質麩皮。

試劑及耗材：氫氧化鈉，乳酸，鹽酸，酚酞，己酸，無水乙醇，葡萄糖，硫酸銅，10 g/L 次甲基藍溶液，pH4.6緩沖溶液，2.5 mol/L硫酸溶液，凡士林，牛肉膏，蛋白胨，瓊脂粉，麥芽浸粉，酵母膏等。

儀器設備：可見分光光度計（721 型，上海悅豐儀器儀表有限公司）；氣相色譜分析儀（GC102AT氣相色譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司）；電子天平（MD200-3 型，上海民橋精密科學儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（101 型，北京市永光明醫療儀器有限公司）；真空抽濾裝置；電熱恒溫水浴鍋（HH-6型，金壇市金南儀器制造有限公司）；循環水式多用真空泵(SHZ-D(Ⅲ)型，天津華鑫儀器廠)；電子萬用爐（DL-100 型，天津市泰斯特儀器有限公司）；搖床；試管；燒杯；玻璃棒等。

1.2 實驗方法

1.2.1 酯化紅曲制作流程

試驗采用以下流程進行：純種紅曲菌→活化→種子培養基→擴大培養→接種→盒子曲→酯化紅曲。

1.2.2 檢測方法

酯化紅曲檢測方法：水分采用電熱烘干法[6]，糖化力采用斐林試劑法[7]，酯化力采用皂化法[8]。

糟醅檢測方法：水分采用電熱烘干法[6]，淀粉采用斐林試劑滴定法[7]，酸度采用酸堿中和法[7]。

1.2.3 實驗方案

方案1：1#池、2#池和3#池添加紅曲量為投糧量5%，減少中高溫曲量為投糧量的2.5%。

方案2：實驗4#、實驗5#和實驗6#添加紅曲量為投糧量3.5%，減曲量為投糧量的1.75%。

方案3：實驗7#、實驗8#和實驗9#添加紅曲量為投糧量2.75%。

2 結果與分析

2.1 紅曲菌篩選分離結果

以宋河中高溫大曲為實驗材料篩選紅曲菌，將中高溫大曲曲心處有粉紅色或紅色菌落的部位分別粉碎，加入一定量的無菌水，于150 r/min，30 ℃搖床上培養1 h 即成菌懸液，靜置1 h 后吸取1 mL上清液加入到9 mL 無菌水試管中，然后依次用無菌水稀釋至10-2～10-7，共7 個梯度，涂布在改良麥芽汁培養基平板上[9-10]。30 ℃恒溫培養3～5 d，挑取具有紅曲菌基本形態特征的菌落，轉接到改良麥芽汁培養基斜面，相同培養條件繼續培養，采用繼代分離純化法進行純化培養[11]。經過多次反復純化培養后，將所得到的純菌種接種到用麥芽汁培養基制作的斜面進行保藏。經過多次篩選純化得到1株紅曲菌，保存于宋河酒業科研中心菌種保藏室。

2.2 酯化紅曲酯化力測定結果

篩選出的紅曲菌經過純化后應用于生產酯化紅曲。采用熟料麩皮培養酯化紅曲，生產出的酯化紅曲菌絲健壯豐滿，色澤紅亮，有一種特殊的酯香，檢測分析酯化紅曲酯化力與中高溫大曲酯化力的不同，其結果見表1。

表1 酯化紅曲與中高溫大曲酯化力結果

由表1 可知，酯化紅曲酯化力水分含量略高于中高溫大曲；酯化紅曲的酸度也略高于中高溫大曲；酯化紅曲的酯化力明顯高于中高溫大曲的酯化力，是中高溫大曲的3倍以上。

2.3 紅曲生產應用實驗結果

2.3.1 實驗前后糟醅理化指標

通過在酒糟中添加一定量的酯化紅曲并且相應地減少一定量的中高溫大曲進行試驗，實驗設計3 個方案，即方案1、方案2 和方案3，3 個試驗方案所添加酯化紅曲的量均不同，每個方案選擇3 條窖池進行試驗。酯化紅曲除具有較強的酯化能力之外還能產生淀粉水解酶和蛋白酶，分解淀粉和蛋白質等，影響糟醅殘余淀粉含量，酸度及水分含量。糟醅中的水分不僅是微生物生化反應所必需的介質、生長繁殖和代謝活動的必要條件，而且在產高質量酒中起著重要作用[12]。糟醅中的酸可以提供有益微生物的營養和生成酒體中各種風味物質并促進酯的生成[13]，試驗前后不同方案中酒糟理化分析結果見表2。

由表2 可知，方案1 中大米查糟醅出池水分相比于入池水分平均增加了18.41%，大米查糟醅出池酸度相比于入池酸度平均增加了2.81 倍，大米查糟醅出池淀粉相比于入池淀粉平均下降了54.84%；方案2 中大米查糟醅出池水分相比于入池水分平均增加了14.72%，大米查糟醅出池酸度相比于入池酸度平均增加了1.95 倍，大米查糟醅出池淀粉相比于入池淀粉平均下降了48.04%；方案3 中大米查糟醅出池水分相比于入池水分平均增加了14.69%，大米查糟醅出池酸度相比于入池酸度平均增加了1.82 倍，大米查糟醅出池淀粉相比于入池淀粉平均下降了41.18%。產酒過程中主要是把淀粉、蛋白質等物質分解成乙醇和水及一些呈香呈味物質，糟醅淀粉下降速度越快，糟醅水分增加越多，產酒能力也越強。方案1 的淀粉下降速度最快、糟醅水分增加也最多，說明同等條件下方案1 產酒較多，這也間接說明酯化紅曲有增加出酒率的能力。

2.3.2 實驗窖池酒樣色譜結果及產量結果

由表3可知，方案1平均產量為339.81 kg，出酒率42.48%；方案1 所產原酒優級酒中己酸乙酯含量平均為3.1734 g/L，相比于對照窖池己酸乙酯高了35.39%，四大酯總含量提高了33.11%，相比于對照窖池乳酸乙酯降低了34.72%；方案1 所產原酒三級酒中己酸乙酯含量平均為1.6793 g/L，相比于對照窖池己酸乙酯高了18.75%，相比于對照窖池乳酸乙酯降低了35.07%。

由表4可知，方案2平均產量為323.83 kg，出酒率40.48%；方案2 所產原酒優級酒中己酸乙酯含量平均為3.1455 g/L，相比于對照窖池己酸乙酯高了34.20%，四大酯總含量提高了16.41%，相比于對照窖池乳酸乙酯降低了41.52%；方案2 所產原酒三級酒中己酸乙酯含量平均為1.6546 g/L，相比于對照窖池己酸乙酯高了17%，相比于對照窖池乳酸乙酯降低了49.22%。

表2 實驗前后糟醅理化指標檢測結果

表3 方案1酒樣色譜分析結果及產量 (g/L)

表4 方案2酒樣色譜分析結果及產量 (g/L)

表5 方案3酒樣色譜分析結果及產量 (g/L)

由表5可知，方案3平均產量為300.38 kg，出酒率37.55%；方案3 所產原酒優級酒中己酸乙酯含量平均為3.0460 g/L，相比于對照窖池己酸乙酯高了29.95%，四大酯總含量提高了18.85%，相比于對照窖池乳酸乙酯降低了37.05%；方案3 所產原酒三級酒中己酸乙酯含量平均為1.6530 g/L，相比于對照窖池己酸乙酯高了16.89%，相比于對照窖池乳酸乙酯降低了45.80%。

表6 混合酒樣色譜分析結果 (g/L)

2.3.3 感官嘗評結果

對所產基酒進行感官嘗評[14]，由3 位國家級品酒師和5 位省級品酒師分別對白酒的色澤、香氣、口味、風格進行品評，并且根據相關文獻[15-16]并結合實際情況進行共同品評打分。其感官嘗評結果見表7。

表7 混合酒樣感官嘗評結果

由表6 與表7 可知，在釀酒生產過程中添加一定量紅曲，所產原酒中己酸乙酯含量明顯增加，乳酸乙酯含量明顯降低；在釀酒生產過程中添加一定量紅曲，其感官嘗評結果相對較好，復合香氣相比對照樣較好，綿柔度優于對照樣；紅曲混合樣優級相比于對照樣優級己酸乙酯含量增加了32.47%，紅曲混合樣三級相比于對照樣三級己酸乙酯含量增加了15.91%；紅曲混合樣優級相比于對照樣優級乳酸乙酯含量降低了36.42%，紅曲混合樣三級相比于對照樣三級己酸乙酯增加了35.62%。

隨著紅曲添加量的增加，所產原酒中己酸乙酯含量也隨之增加，方案1與方案2 之間的差距較小，但均優于方案3。綜合以上因素并結合綜合成本與效益初步認定方案2 較好，即釀酒生產過程中添加紅曲量為投糧量3.5%，減曲量為投糧量的1.75%時原酒產質量較好。

3 討論

本實驗以宋河中高溫大曲為實驗材料，選取曲心處呈紅色或粉紅色部位，通過富集，初篩復篩，并根據紅曲菌菌落形態特征及顯微鏡觀察初步確定1株紅曲菌。以熟料麩皮為小試培養基生產酯化紅曲，生產出的酯化紅曲菌絲健壯豐滿，色澤紅亮，有一種特殊酯香，且其酯化力是普通中高溫大曲酯化力的3倍以上。

通過在釀酒生產過程添加不同比例的酯化紅曲進行實驗，結果表明，添加酯化紅曲的實驗窖池其原酒己酸乙酯和總酯含量明顯增加，原酒感官嘗評結果明顯較好，添加酯化紅曲的窖池所產原酒窖香濃郁，復合香氣好，綿柔度好，后味凈，風格突出。3 種添加方案對比可知，方案1 和方案2 增加較為明顯，綜合以上因素并結合綜合成本與效益，初步認定方案2 較好，即釀酒生產過程中添加紅曲量為投糧量3.5%，減曲量為投糧量的1.75%時，原酒產質量較好。

本實驗為生產性實驗，濃香型白酒生產過程屬于開放性過程，可能會受到許多外界自然因素和人為因素的干擾。在以后的實驗過程中會盡量避免外界因素的干擾及增加平行試驗的次數，以確保實驗的準確性、可靠性和可重復性。