響應(yīng)面優(yōu)化低共熔溶劑提取烏龍茶多糖的研究

黃秀紅，劉麗辰，阮懌航，程博思，林金科，2，*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建福州350002）

茶多糖在降血糖、抗炎、抗凝、抗血栓、抗輻射、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、免疫刺激和抗病毒活性等方面發(fā)揮著重要的生物活性作用[1-4]。茶多糖作為功能性食品中的天然產(chǎn)品具有很大的潛在應(yīng)用，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域[5-7]。在六大茶類中，烏龍茶中的茶多糖含量較高。

茶多糖的主要提取方法有水提取法、微生物提取法、酶提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助法、超臨界CO2提取法、反膠束技術(shù)提取法等[8-13]。傳統(tǒng)的提取方法，由于存在提取率低、時(shí)間長(zhǎng)等不足，較難以滿足產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求。有機(jī)溶劑液液萃取需要使用多種有機(jī)溶劑，且有機(jī)溶劑的用量大，工序比較煩瑣，加熱時(shí)間長(zhǎng)，引起茶多糖的氧化損失比較大，使茶多糖的抗氧化活性降低。因此，研究綠色環(huán)保高效茶多糖的提取技術(shù)對(duì)提高茶多糖的提取效率和抗氧化活性具有重要意義。

低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DESs）由于特定的性質(zhì)被歸類為一種離子液體，可以與單個(gè)或多個(gè)絡(luò)合物結(jié)合。由于DESs獨(dú)特的理化性質(zhì)，目前在活性成分提取、分離和分析等方面得到應(yīng)用。DESs具有低成本、時(shí)間短、易合成、生物可降解、高增溶、低毒性甚至非毒性等特點(diǎn)[14-16]。因此，本研究采用DESs，結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化方法，探索烏龍茶多糖的綠色環(huán)保高效提取技術(shù)，為烏龍茶資源綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏龍茶：福建惜緣茶葉有限公司；無(wú)水乙醇、重蒸苯酚、濃硫酸、乙酸乙酯、氯化膽堿、甜菜堿、1，3-丁二醇、水楊酸、雙氧水：國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。AB-8樹(shù)脂、D101樹(shù)脂PHD500樹(shù)脂：鄭州勤實(shí)科技有限公司。

恒溫水浴鍋（HH-6）：國(guó)華電器有限公司；水浴搖床（MQS-30S）：旻泉儀器有限公司；電子天平（GL-124-1SCNsartorius）：上海精天電子儀器有限公司；可見(jiàn)分光光度計(jì)（721N）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9123A）：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DESs的制備

參照XIA等[17]合成方法，不同氫鍵供體和氫鍵受體按照一定的比例置于250 mL燒杯中，在80℃下加熱攪拌，直至形成均勻的液體。DESs組成如表1所示。

表1 不同DESs溶劑種類的合成及其配比Table 1 Synthesis and ratio of different DESs solvent species

1.2.2 粗茶多糖的提取

將干燥的烏龍茶用高速粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80目篩，放冰箱備用。精確稱取2.00 g茶粉于離心管中，加入DESs12 mL，蒸餾水28 mL[（料液比1∶20（g/mL）]混合均勻，于60℃下恒溫浸提，用抽濾機(jī)抽濾，再用高速離心機(jī)離心30 min（3500 r/min）取上清液，將上清液濃縮，加入5倍體積的無(wú)水乙醇，靜置過(guò)夜，次日離心30 min（3 500 r/min）收集沉淀，分別用無(wú)水乙醇、乙酸乙酯洗滌沉淀，每次洗滌充分?jǐn)嚢瑁哉麴s水提取茶多糖方法作對(duì)照，將所有沉淀物溶于水，定容至250 mL容量瓶中。

1.2.3 茶多糖含量的測(cè)定

參照李濤[18]的方法進(jìn)行。

1.2.4 單因素考察

以茶多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察低共熔溶劑類型（DES-1、DES-2、DES-3、DES-4、DES-5、DES-6）、低共熔溶劑含水率（40%～100%）、固液比[1 ∶10（g/mL）～1 ∶50（g/mL）]、提取溫度（40 ℃～80℃）、提取時(shí)間（20 min～100 min）對(duì)多糖得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)曲面方案設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上確定3個(gè)獨(dú)立變量，包括提取時(shí)間、提取溫度和含水率，運(yùn)用響應(yīng)面分析軟件Box-Behnken，以多糖得率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析，確定茶多糖提取最佳工藝條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 因素與水平Table 2 Factor and levels

1.2.6 多糖的純化

1.2.6.1 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理、分析、篩選

根據(jù)馬若影[19]的方法進(jìn)行。

1.2.6.2 大孔樹(shù)脂效果評(píng)價(jià)

按照藍(lán)海波等[20]的方法進(jìn)行。

1.2.7 茶多糖抗氧化的測(cè)定

1.2.7.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

根據(jù)馮麗琴[21]的方法進(jìn)行。

1.2.7.2 對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定

根據(jù)SMIRONFF等[22]的方法進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有的試驗(yàn)均平行重復(fù)3次，使用SPSS17.0和Design Expert8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用Design Expert8.0.6進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸分析，其中p＜0.05具有顯著性差異，p＜0.01具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 低共熔溶劑和提取條件的篩選

2.1.1 不同DESs類型對(duì)茶多糖得率的影響

探討6種DESs對(duì)茶多糖得率的影響，如圖1所示。

圖1 不同DESs類型對(duì)茶多糖得率的影響Fig.1 Effect of different DESs on the yield of tea polysaccharides

DES-6多糖得率最高，達(dá)到4.90%。考慮到提取得率，DES-6比其他DESs具有更好的性能，這可能是由于更高的氫鍵能力和DESs與多糖的多靜電相互作用，且1，3-丁二醇的醇基分支少，內(nèi)部空間大。因此，DES-6更適合茶多糖的提取。

2.1.2 DES-6含水率對(duì)茶多糖得率的影響

提取得率很大程度上取決于DESs溶液的含水率，結(jié)果如圖2所示。

DES-6溶劑含水率在40%～80%時(shí)，多糖得率逐漸增加，在80%時(shí)達(dá)到最大值，DES-6溶劑含水率在80%～100%時(shí)，多糖得率逐漸減少。這主要是因?yàn)榈秃实腄ESs溶劑難以滲透到植物細(xì)胞中獲得高提取率，而過(guò)高的含水率會(huì)增加混合物的極性，降低甜菜堿，1，3-丁二醇與多糖間的相互作用。

圖2 不同含水率多茶多糖得率的影響Fig.2 Effect of yield of polysaccharides with different water content

2.1.3 DES-6提取溫度對(duì)茶多糖得率的影響

提取溫度是影響提取率的關(guān)鍵因素，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同溫度對(duì)茶多糖得率的影響Fig.3 Effect of different temperatures on the yield of tea polysaccharides

多糖得率隨著溫度的升高而增加，在60℃達(dá)到最大值5.70%，之后隨著溫度的升高，多糖得率下降。雖然較高的溫度會(huì)提高提取得率，但是可能無(wú)法承受多糖的熱降解，導(dǎo)致多糖得率下降。因此，確定60℃為最佳提取溫度。

2.1.4 DES-6固液比對(duì)茶多糖得率的影響

固液比是提高所需物質(zhì)得率的重要因素，對(duì)得率具有重要影響，結(jié)果如圖4所示。

隨著溶質(zhì)體積的增加，多糖得率增加，在1∶20（g/mL）時(shí)達(dá)到最大值5.68%。然而隨著溶質(zhì)體積的增加。多糖得率不斷下降。其原因是少量的萃取溶劑很容易達(dá)到萃取平衡，這是目標(biāo)化合物的不完全萃取。大量的萃取溶劑雖然會(huì)增加目標(biāo)化合物的浸出率，但也會(huì)導(dǎo)致萃取溶劑的浪費(fèi)和萃取過(guò)程的復(fù)雜化。因此，確定1∶20（g/mL）為最佳固液比。

圖4 不同固液比對(duì)茶多糖得率的影響Fig.4 Effect of different solid-liquid ratio on the yield of tea polysaccharides

2.1.5 DES-6提取時(shí)間對(duì)茶多糖得率的影響

不同時(shí)間對(duì)茶多糖得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同時(shí)間對(duì)茶多糖得率的影響Fig.5 Effect of different time on the yield of tea polysaccharides

多糖得率隨著時(shí)間的增加而增加，在80 min時(shí)達(dá)到最大值6.32%，之后隨著時(shí)間的增加，多糖得率下降。其原因主要是因?yàn)樵谝欢螘r(shí)間內(nèi)，活性成分的溶出率會(huì)隨著時(shí)間的增加而增加，然而達(dá)到一定時(shí)間后，溶液體系滲透壓達(dá)到平衡時(shí)溶出率的變化不大[23]。因此，確定80 min為最佳提取時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化茶多糖提取技術(shù)

2.2.1 統(tǒng)計(jì)分析與模型擬合

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以烏龍茶多糖提取得率為考察響應(yīng)值，根據(jù)響應(yīng)面分析法中Box-Behnken Design的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、含水率（C）為自變量，設(shè)計(jì)三因素三水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)條件及結(jié)果Table 3 Response surface experimental conditions and results

通過(guò)回歸分析，得到烏龍茶多糖提取得率與提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、含水率（C）的二次多項(xiàng)回歸模型：

回歸方程的各項(xiàng)方差分析見(jiàn)表4。

表4 響應(yīng)面分析結(jié)果Table 4 Response surface analysis results

由回歸模型的方差分析可知，模型的回歸方程極顯著（p＜0.000 1），說(shuō)明該試驗(yàn)方法可靠。失擬項(xiàng)不顯著（p=0.148 7＞0.05），說(shuō)明回歸方程能很好地解釋結(jié)果并預(yù)測(cè)最佳條件。多元相關(guān)系數(shù)R2=0.983 9＞95%，可知因變量對(duì)自變量的影響顯著，且模型方程擬合良好。校正決定系數(shù)R2adj=96.31%，說(shuō)明響應(yīng)值的96.31%是由于所選變量引起的。對(duì)各因素進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，從表4可以看出，C對(duì)模型的影響極為顯著（p＜0.01），A和B對(duì)模型的影響顯著（p＜0.05）。由各因素的F值可知，三因素對(duì)茶多糖提取的影響顯著性排序?yàn)椋篊（含水率）＞B（提取溫度）＞A（提取時(shí)間）。

2.2.2 響應(yīng)面分析

3D響應(yīng)曲面圖和2D響應(yīng)等值線圖提供了兩個(gè)獨(dú)立變量之間相互作用的直觀解釋。通過(guò)觀察曲面的傾斜度確定兩者對(duì)響應(yīng)值的影響程度，傾斜度越高，即坡度越陡，說(shuō)明兩者交互作用越顯著。提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）和含水率（C）對(duì)茶多糖得率的影響如圖6。

圖6 各因素相互作用對(duì)茶多糖得率影響的等值線和3D響應(yīng)面Fig.6 Contour map and 3D response surface diagram of the effects of various factors on the yield of tea polysaccharides

C的響應(yīng)曲面的傾斜度最高，說(shuō)明C對(duì)茶多糖的得率的影響最大。該結(jié)果與表4方差分析結(jié)果一致（p＜0.01）。除AB和AC之間的交互曲面較平，其他均有較大的傾斜度，說(shuō)明其他因素對(duì)茶多糖的影響較大。該結(jié)果與表 4 方差分析結(jié)果一致（p＜0.05）。圖 6（c）和（f）的橢圓形相應(yīng)等值線圖顯示了BC之間存在較顯著的交互關(guān)系。

2.2.3 預(yù)測(cè)模型驗(yàn)證

通常需要檢查擬合模型，確保它為實(shí)際系統(tǒng)提供足夠的近似值。除非模型顯示出足夠的擬合，否則進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化擬合響應(yīng)面可能會(huì)產(chǎn)生差的或誤導(dǎo)性的結(jié)果。通過(guò)構(gòu)建殘差的正態(tài)概率圖，檢查正態(tài)性假設(shè)，如圖7所示。

圖7 殘差的正態(tài)概率Fig.7 Normal plot of residual

圖8 殘差與預(yù)測(cè)響應(yīng)的關(guān)系Fig.8 Relationship between residual and predicted response

由于殘差曲線沿直線近似，因此滿足了正態(tài)性假設(shè)。圖8給出殘差與方程預(yù)測(cè)值的對(duì)應(yīng)關(guān)系圖，殘差在顯示器上隨機(jī)散射，表明原始觀察的方差對(duì)于所有值都是恒定的。圖7、圖8所得到的結(jié)果都較符合模型，因此得出結(jié)論，預(yù)測(cè)模型足以描述響應(yīng)面的提取得率。

使用Design-Expert軟件，提取物的自變量和響應(yīng)變量的最佳提取條件如下：提取時(shí)間（A）81.27 min，提取溫度（B）61.45℃，含水率（C）83.73%，最大預(yù)測(cè)得率為6.84%。考慮到實(shí)際應(yīng)用的方便，對(duì)3個(gè)因素試驗(yàn)值進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整：A=81 min，B=61℃，C=84%，利用改進(jìn)后的最優(yōu)條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，茶多糖平均提取率為（6.91+0.21）%，與預(yù)測(cè)值無(wú)明顯差異性（p＞0.05）。因此，該模型適用于茶多糖的優(yōu)化。

2.3 茶多糖純化

按照1.2.6的方法，用不同型號(hào)的樹(shù)脂對(duì)烏龍茶多糖進(jìn)行脫色脫蛋白處理，如圖9所示。

圖9 不同樹(shù)脂加入量對(duì)多糖脫色脫蛋白的影響Fig.9 Effect of different resin addition on decolorization and decolorization of polysaccharides

同一樹(shù)脂不同用量對(duì)多糖脫色除蛋白效果影響很大。弱極性樹(shù)脂AB-8樹(shù)脂在用量為0.8 g/mL時(shí)最好，非極性樹(shù)脂D101樹(shù)脂在用量為0.6 g/mL時(shí)最好，極性樹(shù)脂PHD500樹(shù)脂在0.2 g/mL時(shí)最好。3種樹(shù)脂脫色脫蛋白效果對(duì)比見(jiàn)表5。

表5 3種樹(shù)脂脫色脫蛋白效果對(duì)比Table 5 Comparison of decolorization and deproteinization effects of three kinds of resins

如表5可知，AB-8和PHD500的脫蛋白效果較好，但脫色率和多糖保留率相對(duì)較低。D101脫色率較好，多糖保留率較高，且綜合評(píng)分較高。綜合考慮，最終選用D101樹(shù)脂進(jìn)行下一步的多糖純化試驗(yàn)。

2.4 茶多糖抗氧化活性能力

2.4.1 DPPH自由基清除活性

不同濃度茶多糖對(duì)DPPH自由基清除率的作用如圖10所示。

圖10 茶多糖對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.10 Tea polysaccharides to DPPH free radical scavenging ability

從圖10中可以看出，在樣品濃度為0.04 mg/mL～0.2 mg/mL范圍內(nèi)，DES-6、水和VC對(duì)DPPH自由基的清除能力與多糖濃度呈正相關(guān)。當(dāng)濃度為0.2 mg/mL時(shí)，DES-6提取多糖的DPPH自由基清除率（91.44±1.15）%，比常規(guī)水提多糖的清除率（59.44±2.45）%高。樣品的IC50值越小，其抗氧化能力越強(qiáng)。DES-6的IC50為 0.073，水的 IC50為 0.158，VC的 IC50為0.092。DES-6的抗氧化能力最強(qiáng)，VC的抗氧化能力次之，水的抗氧化能力最弱。DES-6的抗氧化能力與水的抗氧化能力比相對(duì)提高了53.79%，DES-6的抗氧化能力相比VC的抗氧化能力相對(duì)提高了20.65%。可見(jiàn)，用DES-6提取的茶多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用明顯，并且隨著多糖濃度的增加，清除能力增強(qiáng)，表明茶多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力與其濃度具有明顯的量效關(guān)系。

2.4.2 羥自由基清除活性

不同濃度茶多糖對(duì)羥自由基清除率的作用如圖11所示。

圖11 茶多糖對(duì)羥自由基清除能力Fig.11 Tea polysaccharides scavenging ability of hydroxyl radicals

從圖11中可以看出，在樣品濃度為0.1 mg/mL～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，DES-6、水和VC對(duì)羥自由基的清除能力與多糖濃度呈正相關(guān)。當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí)，DES-6提取多糖的DPPH清除率（87.77±1.71）%，比常規(guī)水提多糖的清除率（78.70±1.12）%高。DES-6的IC50為 0.196，水的 IC50為 0.291，VC的 IC50為 0.206。DES-6的抗氧化能力最強(qiáng)，VC的抗氧化能力次之，水的抗氧化能力最弱。DES-6的抗氧化能力與水的抗氧化能力相比提高了32.65%，DES-6的抗氧化能力與VC的抗氧化能力相比提高了5.10%。可見(jiàn)，用DES-6提取的茶多糖對(duì)羥自由基的清除作用明顯，并且隨著多糖濃度的增加，清除能力增強(qiáng)，表明茶多糖對(duì)羥自由基的清除能力與其濃度具有明顯的量效關(guān)系。

3 結(jié)論

以響應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化DESs提取條件，確定茶多糖的最佳提取方法。結(jié)果表明，由甜菜堿和1，3-丁二醇組成的低共熔溶劑最適合茶多糖的提取。通過(guò)評(píng)估不同操作參數(shù)對(duì)茶多糖提取的影響，確定提取的最佳工藝參數(shù)，得到最佳提取條件為提取時(shí)間81 min，提取溫度 61℃，含水率 84%，固液比 1∶20（g/mL），茶多糖的得率可達(dá)到6.91%。比較3種樹(shù)脂脫色脫蛋白的效果，并選用D101樹(shù)脂對(duì)茶多糖進(jìn)行初步純化。采用DES-6提取的茶多糖有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力。因此具有綠色環(huán)保高效的低共熔溶劑作為提取介質(zhì)，對(duì)提高茶多糖的提取得率和抗氧化活性具有重要意義。