響應面法優化蛋清蛋白堿法凝膠化條件

張高陽，丘佳韻，彭佳佳，汪學榮

（西南大學動物科學學院，重慶402460）

皮蛋作為我國傳統再制蛋加工制品之一，別名有松花蛋、變蛋、彩蛋等。皮蛋的風味獨特，香醇可口，并且營養成分豐富，含有大量的優質蛋白質、維生素和微量元素，具有易吸收、清熱解毒等特點，從而受到大眾的喜愛[1]。但隨著人們食品健康安全意識的逐步提高，傳統的皮蛋生產制造工業面臨著極大的挑戰，同時在生產工藝方面也有很多地方有待改進。例如生產加工中使用的氧化鉛（lead oxide，PbO）危害人體健康[2]，咸蛋黃生產過程中蛋白過咸，油脂的抗氧化能力下降，不宜食用[3]，但如果丟棄在環境中，容易造成蛋白質資源的極大浪費。另外傳統皮蛋加工過程中的深加工程度、原料蛋品質、生產技術的先進性等問題也值得大家反思，因此對于如何優化生產流程，提高生產效率，降低生產成本、減少破損率就成為了困擾廣大蛋制品生產廠家的“心病”[4-5]。

目前對蛋清蛋白堿誘導的研究主要集中于對蛋白質濃度、pH值、加熱溫度、加熱時間等諸多單一因素的影響[6]。例如一些學者研究了蛋清在酸、堿作用下的凝膠化現象，發現蛋清在pH 2.3以下或pH 12.0以上都會形成凝膠，在pH 2.3～12.0之間則不發生凝膠化[7]。此外，Croguennec等[8]研究發現不同的金屬離子pH值對蛋清蛋白質凝膠性能有顯著影響；pH值為7時，Fe3+、Ca2+和Mg2+能影響凝膠的粘彈性和微觀結構且Fe3+最為顯著；而高濃度的氯化鈉（sodium chloride，Na-Cl）能降低凝膠的持水力。但直到如今科研人員對通過控制多因素來優化蛋清蛋白堿誘導凝膠，促進凝膠結構的穩定性的研究仍有欠缺[9]。通過一系列預試驗和理論分析，擬將蛋清和蛋黃分離，蛋清用作皮蛋的原材料，蛋黃則用來制作咸蛋黃等其他產品。直接向蛋清中加入一定量的可食用堿[10]，這樣做既能簡化工藝流程，縮短生產周期，又能節約成本，與傳統皮蛋及其制品的加工工藝相比，生產效率得到了顯著提高。本試驗以蛋清為原料，將食用堿與蛋清直接混合，通過響應面法優化蛋清蛋白堿法凝膠化工藝條件[11]。算出最佳響應值。以期為提高皮蛋及其系列制品生產效率提供基礎數據和有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮雞蛋：榮昌地區市售，檢驗合格；氫氧化鈉（sodium hydroxide，NaOH）（食用級）：衢州市博特化工有限公司。

1.2 儀器與設備

磁力加熱攪拌器（BNCH78-1型）：武漢格萊莫檢測設備有限公司；凝膠強度測試儀（MD-NJ-5型）：臨安豐源電子有限公司；電子分析天平（FA1204B型）：上海建恒儀器有限公司；離心機（H3-18KR型）：湖南可成儀器有限公司；電熱恒溫干燥烘箱（DGH-9140A型）：上海精宏實驗儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（SSY6型）：金壇市富華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NaOH用量對蛋清蛋白堿誘導凝膠性質的影響

以蛋清質量為計算基準，分別添加0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%食用級NaOH于蛋清中，置于40℃恒溫水浴鍋中靜置反應3.5 h，冷卻至室溫（25℃），測定其凝膠強度和持水力。

1.3.2 凝膠化溫度對蛋清蛋白堿誘導凝膠性質的影響

以蛋清質量為計算基準，添加1.2%的NaOH，將蛋清蛋白分別置于 36、38、40、42、44℃恒溫水浴鍋中靜置反應3.5h，冷卻至室溫（25℃），測定其凝膠強度和持水力。

1.3.3 凝膠化時間對蛋清蛋白堿誘導凝膠性質的影響

以蛋清重量為計算基準，添加1.2%的NaOH，將蛋清蛋白置于40℃恒溫水浴鍋中分別靜置反應2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h，冷卻至室溫（25 ℃），測定其凝膠強度和持水力。

1.3.4 蛋清蛋白凝膠化最佳工藝條件的確定

在單因素試驗基礎上，以凝膠強度為響應值，通過三因素三水平響應面試驗確定蛋清蛋白凝膠化的最佳工藝條件。

1.4 測試指標

1.4.1 持水力（water holding capacity，WHC）

取樣品3個不同部位共10g稱重，用規格為150×150 mm的濾紙包裹后置于50 mL離心管中，于25℃、3 000 r/min下離心10 min，將稱量紙剝離后再次稱量，計算公式為：

式中：A為離心前重量，g；B為離心后重量，g。

1.4.2 凝膠強度

采用凝膠強度測定儀測定蛋清蛋白凝膠的強度，每個樣品測定7次，去除最大、最小值后，取剩余5個值的平均值作為其凝膠強度。

1.5 試驗數據收集與處理

2 結果與分析

2.1 NaOH用量對蛋清蛋白堿誘導凝膠性質的影響

固定凝膠化溫度和時間，考察NaOH用量對蛋清蛋白凝膠性質的影響，結果見圖1。

圖1 NaOH用量對蛋清蛋白凝膠強度和持水力的影響Fig.1 Effect of sodium hydroxide on gel strength and water holding capacity of egg albumin

圖1表明，隨著NaOH用量的增加，蛋清蛋白的凝膠強度和持水力均呈現先增加后減小的變化，當NaOH用量為1.2%時，蛋清蛋白的凝膠強度達到最大值0.88 kgf，明顯高于堿添加量較小的樣品（P＜0.05）當NaOH用量為1.0%時，持水力最大值為90.78%。這是由于蛋清蛋白中加入一定量氫氧化鈉后，pH值的增加促進了更多的疏水性氨基酸的暴露，從而促進蛋白鏈的排斥凝結，進而提高了凝膠性質。當堿添加量高于1.2%時，凝膠強度顯著下降（P＜0.05），這是由于加入過量的氫氧化鈉后，強堿性pH值下加熱將會使發生熱聚集的蛋白質解折疊或降解，從而降低了凝膠性質[12]，在強堿性條件下，凝膠的形成時間短、卵白蛋白更易變性、游離基增加，但是表面疏水性不穩定，先增加而后又緩慢下降，從而降低凝膠強度[13]。綜合分析可知，1.2%的NaOH用量為較優添加量，應采用其進行后續優化試驗。

2.2 凝膠化溫度對蛋清蛋白堿誘導凝膠性質的影響

固定NaOH用量和凝膠化時間，考察凝膠化溫度對蛋清蛋白凝膠性質的影響，結果見圖2。

圖2 凝膠化溫度對蛋清蛋白凝膠白凝膠強度和持水力的影響Fig.2 Effect of gelation temperature on gel strength and water holding capacity of egg albumin

圖2表明，隨著凝膠化溫度的增加，蛋清蛋白的凝膠強度和持水力均呈現先增加后減小的變化，當凝膠化溫度為40℃時，蛋清蛋白的凝膠強度達到最大值0.85 kaf，明顯高于溫度較低的樣品（P＜0.05），持水力達到最大值90.70%。陳曉等[14]研究發現蛋清蛋白在25℃加熱時，便能促進隱藏的—SH的暴露和氧化，加快—SH與S—S鍵的相互轉化，增強凝膠結構。40℃以后凝膠強度下降不顯著（P＞0.05）這是因為在40℃以后加熱時，較高的溫度會破壞蛋白質交聯的氫鍵，阻礙蛋白質進一步吸附水分。在50℃加熱時，凝膠還可能因為分解而失去彈性[15]。結合分析可知，凝膠化溫度為40℃為較優反應溫度，應采用其進行后續優化試驗。

2.3 凝膠化時間對蛋清蛋白堿誘導凝膠性質的影響

固定NaOH用量和凝膠化溫度，考察凝膠化時間對蛋清蛋白凝膠性質的影響，結果見圖3。

圖3 凝膠化時間對蛋清蛋白凝膠白凝膠強度和持水力的影響Fig.3 Effect of gelation time on gel strength and water holding capacity of egg albumin

圖3表明，隨著凝膠化時間的增加，蛋清蛋白的凝膠強度和持水力均呈現先增加后減小的變化，當凝膠化時間為4 h時，蛋清蛋白的凝膠強度達到最大值0.87 kgf，明顯高于凝膠化時間較短的樣品（P＜0.05），當凝膠化時間為3.5 h時，持水力達到最大值86.93%。當時間超過4 h時，凝膠強度顯著下降（P＜0.05），這是由于氫氧化鈉與蛋白質反應時間過長，過量的堿會使蛋白質帶上較多的負電荷，從而產生較大的靜電斥力，破壞蛋白質分子間的結合，以及蛋白質和水分子間的結合[16]，使凝膠結構變得松散并液化，使部分結合水又變回自由水，降低持水力，出現“堿傷”現象[17]。孫靜等對皮蛋工藝的研究發現熱處理時間在0～4 h的持水力、凝膠性質、彈性以及硬度較為理想[18]，相對于熱誘導凝膠最后趨于形成較大的硬度[19]，輕度堿傷的皮蛋也能夠恢復原本的形態。綜合分析可知，凝膠化時間4 h為較優反應時間，應采用其進行后續優化試驗。

2.4 蛋清蛋白凝膠化最佳工藝條件的確定

2.4.1 響應面試驗設計及結果

在單因素試驗基礎上，利用Design Expert8.0軟件，采用Box-Behnken試驗設計，以NaOH用量、凝膠化溫度和凝膠化時間為自變量，以凝膠強度為響應值，對蛋清蛋白凝膠化條件進行優化，因素水平見表1，試驗結果見表2。

2.4.2 回歸模型的建立與檢驗

使用Design Expert8.0軟件對表2中的試驗數據進行二次多項回歸擬合，可得到凝膠強度（y）對自變量X1（NaOH用量）、X2（凝膠化時間）、X3（凝膠化溫度）的回歸方程式（1）：

表1 因素水平表Table 1 Factor and level

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken

回歸方程方差分析見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

續表3 回歸方程方差分析Continue table 3 Variance analysis of regression equation

由表3可知：顯著性檢驗：**P＜0.000 1，在 α=0.01水平上差異極顯著，建立的模型與實際情況較相符，試驗誤差小，說明回歸方程能較合理的預測凝膠化處理條件對蛋清蛋白凝膠強度的影響；失擬性檢驗：*P=0.471 1＞0.05，在α=0.05水平上失擬差異不顯著，即不存在失擬因素，得到的模型與期望的函數模型較相符，模型擬合度高[20]。各凝膠化條件的回歸方程一次項的回歸系數的絕對值大小之比為X1＞X2＞X3，表明了凝膠化條件對蛋清蛋白的影響大小及順序為：NaOH用量＞凝膠化溫度＞凝膠化時間。

另外，而 X1、X2、X12、X22、X32、X2X3在 α=0.01 水平上差異極顯著（**P＜0.01），X3、X1X2、X1X3、在 α=0.05 水平上差異不顯著（P＞0.05），說明三者共同作用時，凝膠化時間與凝膠化溫度對蛋清蛋白凝膠強度的影響大，三者單一作用時均對凝膠強度有較為明顯的影響。去除失擬項后得到如下方程（2）：

2.4.3 交互作用分析

響應面分析圖直觀地顯示了凝膠化過程中各因素之間的交互作用，考察在某一個因素固定為中心值不變時，其他兩個因素的交互作用對凝膠強度的影響[21]。根據回歸方程，作出響應面分析圖和等高線圖，部分因素的交互作用如圖4～圖6所示。

響應曲面圖可直觀地看出各因素交互作用對凝膠強度的影響，曲面越陡峭，說明該因素對其影響越大，交互作用越顯著。等高線形狀為橢圓表示兩因素間的交互作用顯著，圓形等高線表示交互作用不顯著[22-23]。由圖4可以看出凝膠化時間與NaOH用量之間的交互作用較弱，凝膠化時間對凝膠強度的影響略大于NaOH用量；由圖5可知凝膠化溫度與NaOH用量之間的交互作用較為明顯，在固定凝膠化溫度和時間的條件下，減少NaOH用量有助于提高凝膠強度；最后兩張圖表明凝膠化時間與凝膠化溫度之間的交互作用顯著，表現為響應面曲線較陡峭，等高線較密集且呈現橢圓形。以上結果均與回歸分析結果相吻合。

圖4 NaOH用量和凝膠化時間對蛋清蛋白凝膠強度的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plot of alkali dosage and gelation time on egg albumin gel strength

圖5 NaOH用量和凝膠化溫度對蛋清蛋白凝膠強度的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plot of alkali dosage and gelation temperature on egg albumin gel strength

圖6 凝膠化溫度和凝膠化時間對蛋清蛋白凝膠強度的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of gelatinization gel temperature and gelation time on egg protein gel strength

2.4.4 蛋清蛋白最優凝膠化條件的確定與驗證

Design Expert8.0軟件對回歸模型求解后得出的最佳凝膠化條件為：NaOH用量0.8%，凝膠化溫度42℃，凝膠化時間4 h，最大凝膠強度為0.936 kgf。以此為凝膠化條件，最后進行3組平行試驗，得出的蛋清蛋白凝膠強度為0.933 kgf，與理論預測值0.936 kgf的相對誤差為1.003%，小于2%，表明二者數值相近，預測值與實際值較為符合。

3 結論

NaOH用量、凝膠化溫度和凝膠化時間對蛋清蛋白凝膠強度均有不同程度的影響，通過響應面法獲得優化條件為NaOH用量0.8%，凝膠化溫度42℃，凝膠化時間4 h，綜合在不同條件下持水力的變化趨勢，在最優凝膠化條件下凝膠強度的預測值為0.936 kgf，實際值為0.933 kgf，二者相近，優化結果可靠。目前就改性對于蛋清蛋白凝膠性質影響的研究尚處于探索階段，暫時還沒有一種很好的改性方法能夠使蛋清蛋白的凝膠彈性、強度、穩定性和透明性等有目的地加以改變，如果在這個領域能有所突破，那么將可以利用其提高肉制品，方便面制品的營養價值和對其理化性質進行改良，所以對此方面的研究應該更深入的進行下去，這將會成為今后蛋清蛋白研究領域的一個重要的趨勢，也是食品深加工行業的一種趨勢。目前大家對于蛋清蛋白起泡性、乳化性等方面的研究還不太深入，由于蛋白質的各項功能特性之間是相互關聯的，因此加強蛋清蛋白凝膠性與其溶解性、乳化性以及起泡性等之間關系的研究也是有很大的實用價值。