宣木瓜抑菌特性及其飲料的活性成分研究

商亞芳，苗俊豪，張一格，曹衡，蔡華珍，賈小麗，步顯勇，謝艷，魏兆軍，*

（1.滁州學院滁州學院博士后工作站，安徽滁州239000；2.合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽合肥230009；3.滁州學院生物與食品工程學院，安徽滁州239000；4.安徽盼盼食品有限公司，安徽滁州239000）

宣木瓜為薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠[Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai]果實，習稱“皺皮木瓜”，是安徽省宣城市的道地藥材，是我國特有的藥食兩用保健型水果。中醫認為木瓜有舒筋、活絡、健脾開胃、舒肝止痛、祛風除濕之功效[1]。已有研究表明，宣木瓜中含有糖類、齊墩果酸、熊果酸、有機酸、黃酮類等物質，具有保肝、抗炎鎮痛、祛風除濕、抗腫瘤、增強免疫力等功效[2-14]。利用水和乙醇溶液提取獲得的宣木瓜粗提物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌等有害菌具有抑制作用，但抑菌活性成分的分布尚未明確[15]。本研究以宣木瓜為研究對象，利用平板打孔法逐步篩選抑菌活性成分，明確具有抑菌活性的成分在宣木瓜粗提物中的分布。宣木瓜由于口感酸澀，不能直接作為新鮮水果食用，果脯由于含有較高糖分能夠掩蓋其酸澀口感，成為宣木瓜果實的重要加工產品。當地居民通過水浸泡宣木瓜的方法降低其酸澀口感，制作宣木瓜即食飲料食用新鮮的宣木瓜果實，宣木瓜果實經水長時間浸泡后會損失大量的水溶性活性成分，降低宣木瓜的食用價值。本研究利用乳酸菌發酵宣木瓜，進行宣木瓜飲料的開發，該產品保留了宣木瓜的所有有效成分，利用宣木瓜中含有大量有機酸及抑菌活性成分的特性，不添加任何防腐劑和色素等食品添加劑，口感微酸，風味宜人，具有一定的營養保健價值。本研究重點考察了宣木瓜飲料在冷藏過程中，內部活性成分包括多糖、三萜、黃酮、多酚類化合物及抗氧化活性的變化，為研究宣木瓜飲料成品在冷藏過程中的穩定性奠定了一定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宣木瓜：宣城市宣海棠食品有限公司；乳酸菌：北京日創電器；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylocaccus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由合肥工業大學微生物實驗室提供；槲皮素、熊果酸、維生素C、兒茶素等（均為色譜純）：國家標準品檢定研究所；乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿均為分析純，培養基原輔料均為化學純：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SPX-150B-Z型MODEL生化培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；JYZ-V907九陽榨汁機：九陽股份有限公司；TDL-40B離心機：上海安亭科學儀器廠；DFT-100多功能中藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-300 VDE型雙頻數控超聲波清洗機：昆山市超聲儀器公司；SPX－150B－Z型MODEL生化培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；LDZX－40型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；pH計：梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；E－poch2酶標儀：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取宣木瓜提取物

將宣木瓜干制品烘干至水分小于5%后粉碎，過40目篩，密封備用。稱取10 g宣木瓜粉，按料液比1 ∶15（g/mL）加入 70%乙醇 150 mL，進行回流提取，提取時間為3 h獲得提取液，經離心后，取上清液進行旋轉蒸發，獲得宣木瓜提取物固態浸膏4.0 g。

1.3.2 宣木瓜抑菌試驗

將宣木瓜提取物配置成濃度為0.5 g/mL的粗提物原液。牛肉膏蛋白胨培養基的制備：取牛肉膏，氯化鈉各1 g，胰蛋白胨2 g，瓊脂4 g加入水200 mL，溶解后，放入高壓滅菌鍋，121℃，滅菌20 min。

1.3.3 菌懸液的制備

將冷凍保存的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在無菌條件下劃線接種至平板培養基，在37℃恒溫箱培養24 h；轉接2次，得到長勢良好的菌種，置于0℃～4℃下冷藏備用。分別挑取各菌種經24 h活化培養后的單菌落在無菌條件下接種至已滅菌的含有100 mL液體培養基的三角燒瓶中，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌在37℃、200 r/min搖床培養，酵母菌和黑曲霉菌在28℃、200 r/min搖床培養，采用平板計數法使其菌懸液濃度大約為106CFU/mL～107CFU/mL，存放于4℃的冰箱中保存[16]。

1.3.4 牛津杯抑菌試驗

參照文獻方法[17-18]，稍作改動，每組做3個平行，放置于37℃培養箱靜置培養，以蒸餾水代替宣木瓜提取物作為陽性對照。利用游標卡尺，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，以直徑表示抑菌圈的大小。

1.3.5 宣木瓜抑菌活性成分分離

將宣木瓜提取物用蒸餾水充分溶解后，利用有機溶劑進行分層萃取，分別獲得乙酸乙酯層、正丁醇層、三氯甲烷層和水層。各萃取層經旋轉蒸發后，經蒸餾水溶解分別進行抑菌試驗，各萃取層的抑菌濃度均為0.5 g/mL。

1.3.6 宣木瓜飲料制備工藝流程

原料→選擇→清洗→去籽，切片→發酵→榨汁→離心過濾→混合→稀釋→灌裝→殺菌→冷卻→檢驗→成品

1.3.7 操作要點

1.3.7.1 發酵

選取果皮青色的新鮮宣木瓜，將新鮮的宣木瓜清洗切片，按10 g∶1 g取新鮮的宣木瓜和乳酸菌，乳酸菌為保加利亞乳酸菌和嗜熱鏈球菌按質量比1∶1混合的混合菌。加入蒸餾水，新鮮宣木瓜：蒸餾水為1 g∶10 g。在溫度30℃～45℃培養24 h～36 h，得到新鮮宣木瓜的浸泡發酵液和浸泡發酵祛澀的宣木瓜。

1.3.7.2 調配

將新鮮宣木瓜的浸泡發酵液經過濾，得發酵清液備用。將浸泡發酵祛澀的宣木瓜上清液在高速離心機以 3 000 r/min，離心 3 min，使用 0.45 μm 濾膜過濾，得上清液。按體積比2 mL∶3 mL將發酵清液和上清液混合，得到高濃度混合果汁，按體積比1 mL∶2 mL在高濃度混合果汁中加入蒸餾水進行稀釋，得到口感適宜的宣木瓜功能飲品。調配優化方法參考相關專利[19]：一種抗氧化宣木瓜功能飲品（申請號：201710863172.5）

1.3.7.3 均質殺菌

將調配好的復配飲品進行均質，均質前進行預熱，達到60℃～65℃，均質壓力為10 MPa～20 MPa。將得到的宣木瓜低澀飲料在殺菌鍋中110℃殺菌30 min。

1.4 宣木瓜飲料指標測定

為了進一步明確宣木瓜低澀飲料內有效活性成分的穩定性，試驗設置冷藏的3個不同階段[新鮮飲料（A），冷藏 40 d后（B），冷藏 90 d后（C）]，對飲料內部的有效成分（多糖、三萜、黃酮、多酚、抗氧化活性）進行測定。理化指標：采用pH計測定酸度。微生物指標：按GB 4789.10-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》、GB4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》、GB4789.3-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》規定的方法檢驗，檢驗單位為CFU/mL。

1.4.1 多糖的測定

用苯酚-硫酸方法測定宣木瓜提取物中的多糖含量。稱取于105℃烘干至恒重的葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶定容，配成濃度為0.04 mg/mL葡萄糖母液。取0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2.0 mL 于試管中加蒸餾水至2.0 mL，加入1 mL 6%苯酚，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置5 min，沸水浴中加熱30 min，迅速冷卻至室溫25℃，于490 nm處測吸光值，繪制標準曲線。取0.05 mL飲料于試管中加蒸餾水至2 mL，加入1 mL 6%苯酚，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置5 min，沸水浴中加熱30 min，迅速冷卻至室溫25℃，于490 nm處測吸光值，檢測宣木瓜中多糖含量，并以葡萄糖當量進行表示[mg葡萄糖當量（G）/mL飲料]。

1.4.2 三萜的測定

采用香草醛-冰醋酸方法測定宣木瓜提取物中的三萜類化合物含量。精確稱取于80℃烘干至恒重的熊果酸4.6 mg于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容。取0.0、0.1、0.4、0.8、1.2、1.6 mL 標準熊果酸溶液，于 80 ℃水浴鍋中揮發乙酸乙酯。加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，72%硫酸5 mL，于65℃恒溫水浴鍋中加熱20 min后，于冰水中靜置5 min。樣品于532 nm處測定吸光值，繪制標準曲線。取宣木瓜飲料1 mL，于80℃水浴鍋中揮發溶液，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，72%硫酸5 mL，于65℃恒溫水浴鍋中加熱20 min后，于冰水中靜置5 min。樣品于532 nm處測定吸光值。檢測宣木瓜中三萜含量，并以熊果酸含量的方式進行表示，（mg熊果酸當量（U）/mL飲料）。

1.4.3 總酚的測定

利用福林酚法采用兒茶素作為標準品測定飲料中的總酚含量，試驗方法參考文獻[20]。取稀釋相應倍數的樣品10μL樣品置于96平板中，并依次加入70 μL水和20 μL福林酚試劑（2N）置于暗處反應5 min，加入20%碳酸鈉100 μL后置于暗處反應30 min。利用酶標儀測定混合物在730 nm處的吸光值。兒茶素作為標準品用來測定提取液中的總酚含量。最終結果表示為每毫升飲料中含有兒茶素（E）當量（mg）的總酚。

1.4.4 黃酮的測定

利用AlCl3·6H2O法測定飲料中的黃酮含量[21]。取20 μL 飲料，加入 90 μL 乙醇后加入 100 μL 2%AlCl3·6H2O，置于暗處反應5 min，于430 nm測定讀數。利用槲皮素作為標準品，制定標準曲線。飲料中的黃酮含量以槲皮素當量表示mg槲皮素（Q）/mL飲料。

1.4.5 抗氧化性的測定

采用測定飲料的抗氧化活性，試驗方法參考文獻[21]。采用ABTS法（取宣木瓜提取物液稀釋5倍后，經0.45 μm濾膜過濾，準確稱取33 mg ABTS和28.4 mg過硫酸鉀于100 mL水中充分溶解，置于暗處16 h后使用。取不同體積（10 μL～50 μL）的宣木瓜提取液稀釋至100 μL，與100 μL ABTS置于暗處混合5 min后，用酶標儀于734 nm處讀數，計算宣木瓜提取液清除ABTS自由基的IC50，以維生素C為標準品，并測定其IC50）當自由基清除率為50%時，每100 mL宣木瓜飲料中含有抗氧化活性物質的維生素C當量（mg VC/100 mL飲料）。

利用經過修改的DPPH分析方法分析飲料的抗氧化活性，并以VC作為標準品。利用乙醇作為溶劑準備標準品VC儲備液（1 mg/mL）。利用乙醇稀釋DPPH試劑準備DPPH工作液（0.15 mg/mL）。在分析之前，飲料用乙醇稀釋2倍，取5 μL提取物加于96平板中，加入95 μL乙醇后加入100 μL DPPH溶液，將上樣后的96平板在溫室25℃條件下置于黑暗處靜置30 min，所有樣品均以乙醇作為空白，利用酶標儀與波長515 nm處讀取各樣品的吸收波長，所有樣品以乙醇作為參考對照。結果表示為：當對DPPH自由基清除能力為50%時，每100 mL飲料中含有的抗氧化物質含量的VC當量（mg VC/100 mL飲料）。

2 結果與分析

2.1 宣木瓜抑菌活性

當宣木瓜粗提物濃度為0.5 g/mL時，對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的抑菌圈大小分別為18、22、20 mm，抑菌效果較好。為進一步明確宣木瓜抑菌活性成分的分布，粗提物的水溶液分別經正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取物進行旋轉蒸發干燥后，測定抑菌活性見表1。

由表1可知，各層均有抑菌活性，且乙酸乙酯層抑菌效果最佳，試驗結果表明宣木瓜粗提物中具有抑菌活性的有效成分較多，且處于不同極性范圍。宣木瓜中的熊果酸和齊墩果酸均具有較強的抑菌活性，且經有機溶劑萃取后，熊果酸和齊墩果酸主要富集在乙酸乙酯層，本試驗中乙酸乙酯層具有最強的抑菌活性，可能與熊果酸和齊墩果酸有關[22-23]。然而，各萃取層的具體抑菌活性成分需進一步驗證。

表1 宣木瓜提取物各萃取層的抑菌活性Table 1 Antibacterial activities of different extract layers of Xuan Mugua

2.2 產品質量與衛生標準

本飲料采用專利：一種抗氧化宣木瓜功能飲品（申請號：201710863172.5）中的優化方法獲得，飲料成品呈現乳白色，口感微酸，具有淡淡的清香，經乳酸菌發酵后的宣木瓜中單寧含量降低了78%，有效降低了飲料成品的澀感[24]。飲料的酸度隨著保藏時間的延長出現先下降后上升的趨勢，90 d后pH值由3.3升至3.2，口感變化不大。每升飲料中含有的多酚類化合物相當于兒茶素1.08 g，利用ABTS/DPPH方法測定宣木瓜飲料的抗氧化活性，當自由基清除率為50%時，每升飲料中含有的抗氧化物質分別相當于VC0.57 g和0.34 g[19]。飲料中大腸菌群、菌落總數＜1 CFU/mL，致病菌未檢出，符合衛生標準。

2.3 宣木瓜飲料在冷藏過程中各指標的測定

宣木瓜果實中含有豐富的多糖，三萜及酚類化合物，為了明確宣木瓜飲料在保藏過程中內部活性成分的變化，本試驗檢測了在不同保存期內飲料內部活性成分的變化見表2。

由表2可知，飲料中的多糖含量在90 d內的冷藏期內由初始的0.735 mg葡萄糖/mL降低至0.703 mg葡萄糖/mL飲料，三萜類化合物的含量呈現先上升（由0.245 mg熊果酸/mL上升至0.401 mg熊果酸/mL飲料）后下降（0.322 mg熊果酸/mL飲料）的趨勢，總酚類化合物則在保藏期間持續下降（由1.269 mg兒茶素/mL降至1.101 mg兒茶素/mL飲料），黃酮類化合物出現先下降后上升的趨勢。飲料內部活性成分發生波動性變化，可能是由于飲料在冷藏過程中酸度的變化導致多糖、三萜、多酚和黃酮類化合物的溶解性發生變化。利用ABTS和DPPH測定飲料的抗氧化活性，則發現DPPH方法測得的活性逐漸減小（由10.47 mg VC/100 mL飲料降至6.30 mg VC/100 mL），而ABTS方法則是先下降后上升的趨勢（由7.55 mg VC/100 mL上升至10.09 mg VC/100 mL），ABTS抗氧化活性增強，可能與飲料中三萜，總酚及黃酮總含量的升高有關。兩種方法出現的結果不同，可能是由于二者使用的溶劑載體不同，ABTS方法內主要是水溶性化合物的抗氧化活性，而DPPH方法則是醇溶性化合物起主要作用。

表2 宣木瓜飲料內部活性成分在冷藏期間的變化Table 2 Change of active ingredients in the beverage during refrigeration

3 結論

宣木瓜作為安徽省宣城市藥食同源的道地藥材，具有較高的營養價值、經濟價值和開發前景。本研究發現宣木瓜提取物具有較好的抑菌效果，以宣木瓜為原料，經過發酵，調配，滅菌等一系列工藝制作的飲料在保藏期間的內部活性成分三萜和黃酮含量在冷藏90 d后，含量分別上升了31%和2%，多糖和總酚含量則出現下降，分別下降了5%和14%。酸度變化不大。雖然飲料在儲藏過程中抗氧化活性程度出現波動，但總體仍保持較好的抗氧化活性。本研究為提升宣木瓜精深加工技術水平和綜合開發利用價值奠定了重要基礎。