醬香型蜂蜜配制酒的工藝優化及體外抗氧化能力分析

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025）

醬香型白酒在茅臺酒的帶動下，以其高端國酒優勢，純糧釀造無添加等優良特性，受到越來越多消費者的青睞[1]，且具有“醬香突出，幽雅細膩，酒體醇厚，回味悠久，空杯留香”的鮮明風格，呈現出快速發展的良好態勢。蜂蜜是一種天然的甜味物質，它是由蜜蜂采集花蜜或植物的葉莖上的蜜露或者其它昆蟲的代謝物，然后混合自身所分泌的特殊物質，在蜂巢中經過充分釀制而成的[2]。蜂蜜的使用可以追溯到人類社會開始的時候，曾經被用作一種貨幣或貢品[3]。蜂蜜含維生素、礦物質、酶、風味物質、游離氨基酸和多種揮發性化合物，具有促進糖代謝，解毒，抗腫瘤，增強機體免疫功能，通便利腸等藥理作用[4]。

傳統的蜂蜜酒是以純正蜂蜜為原料，經稀釋、發酵、澄清、過濾、陳釀后制得的低酒精度發酵酒，如今大多數的蜂蜜酒仍以發酵型為主，鮮少有配制型蜂蜜酒。而市場上的配制酒酒基一般為黃酒、米酒與普通白酒，少見將醬香型白酒作為配制酒酒基的報道。本研究將醬香型白酒與蜂蜜結合，并輔以營養豐富且具有藥用價值的枸杞、陳皮、山楂、龍眼干，擬開發一種具有醬香型風味特征的蜂蜜配制酒，既能保留天然蜂蜜的營養和香味，又兼有醬香酒的風味特征。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

陳皮、山楂、枸杞、龍眼干、蜂蜜：市售，其中龍眼干為干制龍眼去殼去核；53%vol醬香型白酒：茅臺鎮某酒廠。

蘆丁標品：貴州迪大生物科技有限責任公司；福林酚：上海源葉生物科技有限公司；DPPH：上海梯希愛化成工業發展有限公司；ABTS：合肥博美生物科技有限責任公司；其余試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器

電子天平（AE100S型）：梅特勒-托利多儀器有限公司；生化培養箱（SPE-150B-Z型）：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；新世紀紫外可見分光光度計（T6）：北京普析通用儀器有限公司；恒溫水浴鍋（HHM6型）：金壇市中大儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 單因素試驗

料液比的確定：在浸泡時間為8 d，溫度為20℃同一條件下，以料液比 1 ∶4、1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12（g/mL）泡制，經過濾后各加入15%蜂蜜進行調配，根據多指標綜合評價法評析，確定最適料液比。

蜂蜜添加量的確定：在浸泡時間為8 d，溫度為20℃，料液比為1∶8（g/mL）同一條件下，泡制過濾后添加5%、10%、15%、20%、25%蜂蜜，根據多指標綜合評價法評析，確定最適蜂蜜添加量。

泡制時間的確定：在溫度為20℃，料液比為1 ∶8（g/mL）同一條件下，設定浸泡時間 4、6、8、10、12 d，泡制過濾后各加入15%蜂蜜進行調配，根據多指標綜合評價法評析，確定最適泡制時間。

泡制溫度的確定：在浸泡時間為8 d，料液比為1 ∶8（g/mL）同一條件下，設定泡制溫度 5、10、15、20、25℃，泡制過濾后各加入15%蜂蜜進行調配，根據多指標綜合評價法評析，確定最適泡制溫度。

1.3.3 響應面設計

在單因素試驗的基礎上，以料液比、泡制時間、泡制溫度、蜂蜜添加量為試驗因素，進行響應面優化試驗，響應面因素及水平見表1。

表1 響應面試驗因素及水平表Table 1 Experimental factors and levels of response surface

1.3.4 醬香型蜂蜜混合配制酒的多指標綜合評價

感官指標在衡量產品質量及產品可接受性中有著不可替代的作用，但我國質量評價體系不完善以及評價技術不成熟造成現在普遍運用的感官評定方法存在著程序復雜、主觀性強、費時、誤差大及不穩定等缺點，無法準確評判產品質量[5]。蜂蜜營養豐富、保健功效顯著，屬天然營養佳品、藥食同源食物[6-7]。很久以前蜂蜜就被用來治療傷口，因為蜂蜜具有抗炎、殺菌劑、抗生素的屬性。Jose M.Alvarez-Suarez等[8]的研究顯示蜂蜜的這種屬性可能與蜂蜜本身含有的酚類物質有關。董蕊等[9]的研究表明蜂蜜中的多酚類物質會影響蜂蜜的抗氧化活性，抗氧化能力與黃酮、酚酸含量呈現正相關的關系。此外，陳皮、山楂中也含有豐富的黃酮類化合物。因此，除了考察感官指標以外，本試驗還將酒體中的功能成分總黃酮含量、酚酸含量納入評判標準中。

多指標綜合評價法（multi－index comprehensive evaluation method，MCEM）通過對各評價指標打分，將各指標最優分值加權加和得總分值來評價處方的優劣[10]。根據各評價因素對酒體質量的影響程度，采用強制決定法[11]，確定感官指標為0.4，總黃酮含量為0.3，酚酸含量為0.3。即：醬香型蜂蜜混合配制酒的綜合評分=總黃酮含量×0.3＋酚酸含量×0.3＋感官評分×0.4。

1.3.5 醬香型蜂蜜配制酒體外抗氧化試驗

自由基具有高度的活性和極強的氧化能力，能夠攻擊體內生物大分子及各種細胞，造成機體在分子水平、細胞水平及組織器官水平的各種損傷，加速機體的衰老并誘發各種疾病。抗氧化物質能夠抑制活性氧簇和自由基的產生，加速清除或者抑制其對大分子的氧化損傷作用。多酚、黃酮類化合物含量豐富的天然產物具有較強的體外抗氧化能力[12]，且其有效成分都具有良好的醇溶性。通過化學方法測定天然產物自由基清除率，能夠評價其抗氧化活性。采用化學法比較醬香蜜酒與原醬香型白酒在清除DPPH自由基、ABTS+自由基、羥基自由基及還原力大小來分析醬香蜜酒的體外抗氧化能力。

1.3.6 指標檢測方法

總黃酮含量的測定：參照文獻[13]；酚酸含量的測定和DPPH自由基清除率的測定：參照文獻[14]；ABTS+自由基清除率的測定：參照文獻[15]；羥自由基清除率的測定：參照文獻[16]；還原力的測定：參照文獻[17]；感官評定：選10名經感官培訓過的研究生同學組成評分小組。參考葡萄酒感官評定標準，采用十分制，取平均值為最終分數，感官評定標準見表2。

表2 醬香型蜂蜜混合配制酒感官評分表Table 2 The sensory evaluation standard of sauce-flavored mead

1.4 數據分析

采用Design-Expert.8.05b設計響應面進行優化與分析試驗，SPSS 22.0用于數據方差分析，每組試驗重復測量3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對醬香蜜酒綜合品質的影響

料液比對醬香蜜酒綜合品質的影響見圖1。

圖1 料液比對醬香蜜酒綜合品質的影響Fig.1 Effect of material to liquid ratio on the comprehensive quality of sauce-flavored mead

由圖1可知，隨著溶劑體積的增大，酒體中黃酮含量、酚酸含量逐漸呈下降趨勢，感官評分逐漸上升，醬香蜜酒的綜合評價緩慢增高，當料液比達到1∶10（g/mL）時，其綜合評價最高。原因是當白酒體積占比較小時，酒體中含較多的黃酮、酚酸等物質，但其果香味過重，當料液比較大時，酒體中黃酮酚酸含量較少且果香味不足。

2.1.2 蜂蜜添加量對醬香蜜酒綜合品質的影響

蜂蜜添加量對醬香蜜酒綜合品質的影響見圖2。

蜂蜜可以看做是一種過飽和的糖溶液，糖和水的量占到其干重的95%以上，維生素、礦物質、酶、風味物質、游離氨基酸和多種揮發性化合物構成次要成分，不過正是其次要成份決定了不同蜂蜜的感官及營養特性[4]。蜂蜜添加量較低時，酒體中總黃酮、酚酸含量也相對較低，但當蜂蜜添加量較高時，黃酮含量、酚酸含量上升平緩，但糖含量偏高，酒體過甜，感官效果較差。由圖2可知，當蜂蜜添加量為15%時，其綜合評價最好。

圖2 蜂蜜添加量對醬香蜜酒綜合品質的影響Fig.2 Effect of Amount of honey added on the comprehensive quality of sauce-flavored mead

2.1.3 泡制時間對醬香蜜酒綜合品質的影響

泡制時間對醬香蜜酒綜合品質的影響見圖3。

圖3 泡制時間對醬香蜜酒綜合品質的影響Fig.3 Effect of brewing time on the comprehensive quality of sauce-flavored mead

由圖3可知，酒體中的黃酮含量、酚酸含量及感官評分都隨著泡制時間的延長緩慢上升。在第8天以后，黃酮含量、酚酸含量上升不大，逐漸穩定，醬香蜜酒此時綜合評價最高。原因是在較短的時間內，浸泡物所含物質未完全溶入酒體，因而總黃酮、酚酸含量不高，酒體感官也更接近于原酒口感風格。隨著時間延長浸出物達到飽和，感官評價也無較大變動。

2.1.4 泡制溫度對醬香蜜酒綜合品質的影響

泡制溫度對醬香蜜酒綜合品質的影響見圖4。

圖4 泡制溫度對醬香蜜酒綜合品質的影響Fig.4 Effect of brewing temperature on the comprehensive quality of sauce-flavored mead

由圖4可知，在溫度為20℃時，醬香蜜酒綜合品質最好。溫度能顯著地影響物質的的溶解度[18]，隨著溫度升高，酒體中的黃酮含量、酚酸含量、感官評分都逐漸上升，最后逐漸趨于平緩。在低溫條件下，總黃酮、酚酸溶解度不高，但溫度若設置過高則會使酒精揮發。

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 試驗結果

以料液比、浸泡溫度、浸泡時間及蜂蜜添加量為自變量，以醬香型蜂蜜混合配制酒綜合評價為響應值進行響應面試驗，Box-Behnken設計方案及試驗結果見表3。

表3 Box-Behnken設計方案及試驗結果Table 3 Box-Behnken design and test results

2.2.2 響應面模型的建立及其顯著性

采用Design Expert 8.0.5軟件對數據進行處理，得到回歸方程方差分析表，進行非線性回歸二次多項式擬合，得到如下回歸方程預測模型：醬香蜜酒綜合評價分值=4.33+0.46A-0.15B+0.013C-0.020D+0.083AB-0.10AC-0.11AD-0.11BC-0.033BD-0.059CD-0.28A2-0.30B2+0.018C2-0.083D2。回歸方程系數顯著性檢驗見表4。

根據回歸方差分析顯著性檢驗，該模型回歸極顯著（p＜0.000 1），失擬項不顯著（p＞0.05），說明模型在回歸區域內擬合較好，與實際擬合中非正常誤差所占比例較小，多元相關系數R2=0.953 9，相關性較好，說明該模型可用于預測最優配方的實際情況。

由表4可知，回歸方程中的料液比（A）、蜂蜜添加量（B）以及二次項 A2、B2均達到極顯著水平（p＜0.01），料液比與時間（AC）、料液比與溫度（AD）、蜂蜜添加量與時間（BC）交互項以及二次項D2達到顯著水平。表明各因素對響應值綜合評價的影響不是簡單的線性關系。方差分析中 FA=147.27，FB=16.68，FC=0.12，FD=0.27。即各因素對醬香蜜酒綜合評價的影響程度大小順序為：料液比＞蜂蜜添加量＞溫度＞時間。

表4 回歸方程系數顯著性檢驗Table 4 Regression equation coefficient significance test

據回歸方程繪制響應面圖，圖形形狀與3D圖傾斜度都能反映出各因素之間的相互關系。等高線為圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形則表示兩因素交互作用顯著；3D圖傾斜度越高，坡度越陡，說明兩因素交互作用越顯著。

圖5 交互項對于醬香蜜酒綜合評價顯著的響應面圖Fig.5 Interaction term for the elastic surface of the comprehensive quality of sauce-flavored mead

從圖5中的（1）、（2）可以直觀地看出，料液比與蜂蜜添加量、蜂蜜添加量與溫度的等高線為圓形，交互作用不顯著，從圖5（3）和（4）可以看出料液比與溫度、料液比與時間的3D圖傾斜度高，交互作用顯著。

2.2.3 響應面最終優化配方及驗證試驗

通過響應面得出料液比為1∶8.3（g/mL），蜂蜜添加量為15%，時間為6 d，溫度為17.82℃為醬香型蜂蜜混合配制酒的最優組合。在此條件下預測醬香型蜂蜜混合配制酒綜合評分為4.63。考慮到醬香蜜酒實際操作的方便性，故將醬香蜜酒的配方組合修正為：料液比為1∶8.3（g/mL），蜂蜜添加量為15%，時間為6 d。溫度為18℃。并在此條件下進行3次平行驗證試驗，醬香蜜酒綜合評價值為4.69，與預測值相比，相對誤差為1.3%，其驗證值與預測值的誤差在允許誤差5%內，說明該模型合理可靠。

2.3 醬香蜜酒體外抗氧化能力分析

對采用最終優化配方制作的醬香蜜酒進行體外抗氧化分析，以基酒醬香型白酒作為對比，比較兩者體外抗氧化能力的強弱，試驗結果見表5。

表5 醬香蜜酒及原醬香型白酒自由基清除率試驗結果Table 5 Experimental results of free radical scavenging rate of sauce-flavored mead and original sauce-flavor liquor

蜂蜜具有較好的抗氧化性是與其黃酮類、酚酸類、抗壞血酸、過氧化氫酶、類胡蘿卜素及美拉德反應產物有關[19-20]。由表5可看出，醬香蜜酒對DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基清除率及還原力分別為87.24%、90.38%、81.25%、1.877，原醬香型白酒對DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基清除率及還原力分別為9.01%、4.26%、8.04%、0.017，其中還原力值越大，其還原能力越強。結果表明醬香蜜酒體外抗氧化能力顯著高于原醬香型白酒。這是因為枸杞、山楂、陳皮、龍眼及蜂蜜中含有較多的抗氧化活性物質。

3 結論

根據單因素試驗的結果，采用響應面分析法建立了料液比、蜂蜜添加量、浸泡時間、浸泡溫度4個因素對于醬香蜜酒綜合評價的二次回歸方程模型，并優化出醬香蜜酒最優的制作工藝。根據響應面方法優化的結果以及考慮到實際操作的方便性，最終確定醬香蜜酒的最優制作工藝為：料液比為1∶8.3（g/mL），蜂蜜添加量為15%，浸泡時間為6 d，泡制溫度為18℃，將醬香蜜酒綜合評價作為響應值，所得驗證試驗結果為4.69，所產生的誤差為1.3%，說明該回歸方程具有較高的可信度。以最終優化配方制作的醬香蜜酒對DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基清除率及還原力分別為87.24%、90.38%、81.25%、1.877，原醬香型白酒對DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基清除率及還原力分別為9.01%、4.26%、8.04%、0.017，醬香蜜酒體外抗氧化能力顯著高于原醬香型白酒，可為醬香蜜酒產品進一步的開發與利用提供理論依據。