固相萃取-高效液相色譜法測定紅糖中有機酸

陳其釗，陳嘉敏，陳紅香，*，王桂華，李家威，余構彬

（1.廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業研究所）廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州510316；2.國家糖業質量監督檢驗中心，廣東廣州510316）

傳統紅糖，又名古法紅糖、原生態紅糖，是甘蔗榨汁后經石灰法清凈處理，直接煮制而成，整個過程中不加入任何化學試劑及食品添加劑，幾乎完全保留甘蔗原有的風味和營養物質。紅糖在我國歷史悠久，一直享有健脾養胃、溫中補氣、緩解精通的溫補美譽，常用作滋補食材。國內外學者研究亦表明，紅糖中的非糖成分具有防齲齒、抗毒素、抗癌以及抗氧化等作用[1-7]。紅糖中含有大量的甘蔗原生態營養物質[8]，包括礦物質、氨基酸、有機酸、酚類物質以及維生素等。其中，有機酸的存在不僅構成紅糖的風味成分，而且可以使紅糖保持較低的pH值，抑制微生物的生長繁殖。國內外有關于研究紅糖有機酸的文獻都很少，多集中于測定紅糖及紅糖原料甘蔗中的有機酸種類和含量，目前人們已經從紅糖中檢測出含有多種有機酸，包括草酸、檸檬酸、蘋果酸、烏頭酸、沒食子酸、乳酸以及富馬酸等[9-11]，國內對于有機酸的研究多以甘蔗發酵液[11]、果汁[12]、乳制品[13]、蜂蜜[14]、茶葉[15]和米酒[16]等為研究對象。對于復雜基體樣品多采用固相萃取法對有機酸進行富集處理且效果良好，常用的分析方法主要為離子色譜法[17-19]、氣相色譜法[20-21]以及高效液相色譜法[22-23]等。有機酸的種類和含量是影響紅糖質量好壞的一個重要因素，建立一種可同時測定紅糖中多種有機酸的方法，可用于快速準確檢測紅糖中的有機酸種類和含量，為紅糖的質量評價、紅糖的開發利用提供相關依據。本文建立固相萃取-反相高效液相色譜測定紅糖有機酸的方法，該方法操作簡單，可同時測定紅糖中的7種有機酸，并為紅糖的質量控制提供相關依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1260 infinity Ⅱ高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器）：安捷倫科技（中國）有限公司；優普UPC-I-60L去離子水系統：四川優普超純科技有限公司；CNWBOND SAX強陰離子交換固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）小柱（200 mg/6 mL）：上海安譜實驗科技股份有限公司；CL5R醫用離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；S22H型超聲提取儀：致微（廈門）儀器有限公司；FE20型pH計：梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司。

酒石酸（≥99.0%）、丙酮酸（≥95.0%）、乙酸（≥99.7%）、檸檬酸（≥99.5%）、琥珀酸（≥99.0%）、沒食子酸（≥98.0%）、烏頭酸（≥98.0%）：上海安譜實驗科技股份有限公司；磷酸（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）：廣州化學試劑廠；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；試驗用水均由超純水系統制備。

1.2 色譜條件

色譜柱：XBridge C8柱（4.6×250 nm，5 μm）；流動相：0.1%H3PO4與乙腈，比例 99 ∶1；流速：0.7 mL/min；柱溫：35℃；進樣 20 μL；檢測波長：210 nm。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的制備

標準儲備液：分別稱取10 mg酒石酸、丙酮酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、沒食子酸、烏頭酸7種有機酸標準品于10 mL容量瓶中，用去離子水溶解并定容，于4℃下避光儲存備用。

混合標準溶液：分別取適量部分上述標準儲備液用去離子水配制成混合標準溶液，其質量濃度分別為：酒石酸20 mg/L、丙酮酸6 mg/L、乙酸70 mg/L、檸檬酸50 mg/L、琥珀酸60 mg/L、沒食子酸0.7 mg/L、烏頭酸3 mg/L。

1.3.2 樣品前處理方法

準確稱取紅糖樣品10g，加入去離子水攪拌溶解，并定容至25 mL，搖勻，轉移至50 mL離心管，4 000 r/min轉速下離心5 min。

CNWBOND SAX SPE小柱依次用3 mL甲醇，3 mL去離子水活化平衡，備用。取離心后的上清液10 mL全部過柱，控制流速在1 mL/min左右，用2 mL去離子水淋洗棄掉全部上樣流出液以及淋洗流出液；用2 mL 1%H3PO4洗脫，收集所有洗脫液于25 mL離心管，混勻后過0.22 μm水相濾膜，濾液收集于進樣小瓶備用于高效液相色譜分析。

2 結果與分析

2.1 SPE條件的優化

2.1.1 SPE柱的選擇

本文分別考察Waters Oasis WAX、Cleanert PAXSPE、poly-sery MAX SPE以及CNWBOND SAX SPE這4種陰離子交換柱對紅糖的凈化富集效果，結果見圖1。

結果如圖1所示，弱陰離子交換柱Waters Oasis WAX與Cleanert PAX-SPE柱的凈化效果較好，能較好減少雜質峰的干擾，而混合型弱陰離子poly-sery MAX SPE柱的凈化效果較差；3種陰離子交換柱對有機酸的吸附作用不強，乙酸、琥珀酸、沒食子酸以及檸檬酸的回收率無法達到試驗要求，且均不能保留丙酮酸和烏頭酸。強陰離子交換柱CNWBOND SAX SPE對紅糖的凈化效果以及對有機酸的保留能力都優于弱陰離子交換柱，能同時保留7種有機酸且回收率滿足試驗要求，因此本試驗擇優選擇SAX固相萃取小柱對樣品進行凈化富集處理。

圖1 4種SPE柱選擇色譜圖Fig.1 Chromatogram of SPE column selection

2.1.2 洗脫劑的選擇

理論上用一定pH值的酸性溶液即可將保留在陰離子柱上的有機酸洗脫下來，本試驗考察6%鹽酸溶液與0.1%磷酸溶液對7種有機酸的洗脫效果，結果見圖2。

圖2 洗脫溶劑選擇色譜圖Fig.2 Elution solvent selection chromatogram

結果如圖2所示，用6%鹽酸溶液進行洗脫時，由于洗脫液強度大，有機酸洗脫的同時，在酒石酸的位置上會出現一些干擾，同時乙酸的回收率也不太好。用0.1%磷酸溶液進行洗脫時，則需要增大洗脫體積；綜合兩種洗脫劑的洗脫情況考慮，嘗試提高磷酸濃度至1%，試驗表明以1%磷酸作為洗脫劑時，7種有機酸的回收率良好。同時從圖中可以看到對于酒石酸無論選用何種凈化柱，洗脫溶液始終存在干擾，因此無法做準確定量。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 流動相的選擇

為了使有機酸能以分子的形式穩定存在，一般使用pH值較低的流動相。本試驗考察3種流動相對有機酸的分離，分別為0.1%磷酸、0.1 mol/L磷酸二氫鈉以及0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液。試驗結果表明：以0.1 mol/L磷酸二氫銨溶液作流動相時，多種有機酸擠在一起出峰，無法分離；比較0.1%磷酸與0.1 mol/L磷酸二氫鈉發現，以0.1%磷酸作為流動相時，7種有機酸的分離度較好，綜合有機酸分離情況考慮，以0.1%磷酸作為流動相為宜。

2.2.2 色譜柱的選擇

本文選擇考察3種不同品牌色譜柱，分別為E－clipse Plus C18柱、Venusil XBP C18柱以及 XBridge C8柱。結果表明：Eclipse Plus C18柱和XBridge C8柱分離有機酸的情況良好，Venusil XBP C18柱不能有效分離各有機酸，多種有機酸峰擠在一起。綜合有機酸分離情況以及色譜柱成本考慮，放棄使用Venusil XBP C18柱，進一步考察Eclipse Plus C18柱和XBridge C8柱分離7種有機酸的情況。Eclipse Plus C18柱無法將烏頭酸與琥珀酸分離，且酒石酸出峰時間與溶劑峰出峰時間相差較小，容易發生峰形基線重疊。XBridge C8柱能有效分離7種有機酸，各有機酸峰形良好且分離度滿足試驗要求，綜合考慮，本試驗選擇XBridge C8柱作為試驗用色譜柱。

2.2.3 流速與柱溫的優化

根據以上流動相以及色譜柱考察，基本確定流動相為0.1%磷酸∶乙腈=99∶1，色譜柱為XBridge C8柱，在此條件下，本試驗考察1、0.5、0.7 mL/min的流速對有機酸分離效果的影響，結果如圖3所示。

圖3 不同流速下7種有機酸分離的色譜圖Fig.3 Separation chromatogram of seven organic acids at different flow rates

比較試驗結果，發現流速為1mL/min時，各有機酸組分保留時間縮短，峰形良好，分析時間在12 min以內，但流速過高，泵的壓力也明顯升高，導致基線不穩且容易降低柱子的使用壽命；而流速為0.5 mL/min時，琥珀酸與沒食子酸基線分離不完全，峰部分重疊；流速為0.7 mL/min時，7種有機酸能有效的分離且峰形均良好，20min內能完成分析。綜合考慮有機酸分離度、分析時間以及基線穩定情況，確定0.7 mL/min的流速為宜。

在上述已確定的色譜條件下，考察30、35、40、45℃的柱溫，結果表明柱溫對各有機酸的保留時間以及分離度有明顯的影響：溫度高，出峰時間前移，有機酸分離度降低；溫度低，出峰時間后移，分析時間過長，且柱溫過高或過低都不能實現對琥珀酸和沒食子酸的分離；柱溫為35℃時，7種有機酸全部出峰，且琥珀酸與沒食子酸分離情況良好，20 min內可完成色譜分析，符合試驗要求，故確定柱溫為35℃。圖4為7種有機酸標準品在上述已確定條件下的色譜圖。

圖4 7種有機酸混合標準溶液的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography chromatogram of the mixed standard solution on of 7 organic acids

2.3 線性關系、檢出限及線性范圍

精確移取一定體積的7種有機酸儲備液至10 mL容量瓶，加去離子水定容，配制成較高濃度的有機酸混合標準溶液。將其分別稀釋1.5倍、2.5倍、5倍、10倍，配成一系列濃度的混合標準溶液，采用1.2節所述色譜條件進樣20 μL分析，以標準溶液濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，以S/N=3和S/N=10分別確定各有機酸在樣品中的檢出限和定量限，結果見表1。

表1 7種有機酸的線性范圍、回歸方程、相關系數與檢出限（S/N=3）Table 1 Linear ranges，regressions，correlation coefficients and detection limits of 7 organic acids（S/N=3）

2.4 精密度和回收率

按1.2節所述色譜條件進行三水平加標試驗，每一加標水平平行測定3次，計算各有機酸回收率，結果如表2所示。

表2 7種有機酸的回收率及精密度（n=3）Table 2 Recoveries and precision of 7 organic acids（n=3）

續表2 7種有機酸的回收率及精密度（n=3）Continue table 2 Recoveries and precision of 7 organic acids（n=3）

7種有機酸的加標回收率為82.1%～108.6%，相對標準偏差為1.1%～3.0%。表明該方法各有機酸的回收率較為穩定，精密度良好，可以滿足樣品中種有機酸的同時測定。

2.5 樣品分析

2.5.1 紅糖樣品分析

按照1.2的色譜條件，對由企業提供的10個紅糖樣品進行了有機酸含量的檢測，每個樣品重復3次。結果見表3。

表3 10個紅糖樣品中7種有機酸的含量測定結果（n=3）Table 3 Determination results of 7 organic acids in 10 brown sugar samples mg/kg

由表3可知，紅糖樣品中檢出的有機酸包括丙酮酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、沒食子酸和烏頭酸，但不同樣品之間在有機酸組成及含量上存在明顯差別。其中乙酸、沒食子酸，烏頭酸所有樣品均有檢出，尤其是烏頭酸含量最高可達7 778.4 mg/kg。說明紅糖中有機酸主要以烏頭酸的形式存在。丙酮酸，檸檬酸，琥珀酸的含量則差異很大；酒石酸未檢出。這些可能與甘蔗產地以及各個廠家的工藝有關。

3 結論

本文通過優化富集紅糖有機酸的SPE條件以及7種有機酸分離的色譜條件，所建立的固相萃取-高效液相色譜法簡單、快速、準確，可快速準確測定紅糖中的7種有機酸含量，該色譜法還可為建立其他食品中有機酸含量的檢測方法提供參考。