基于秀麗隱桿線蟲的真菌毒素毒性評價研究進展

郭亦晨，李珂，2，3，吳中琴，李宗軍，2，3，*

（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410128；3.國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南長沙410128）

真菌污染食品主要發生在糧食作物、油料作物以及發酵食品上。真菌污染食品主要的危害在于真菌產生次級代謝產物——真菌毒素，它是由具有產毒功能的產毒菌株分泌的一種細胞外毒素，主要產生于含有豐富碳水化合物的食品原料或動物飼料。能產生真菌毒素的真菌一般以霉菌為主，霉菌在自然界分布非常廣泛，同時霉菌可以產生許多細小的霉菌孢子，這些霉菌孢子很容易傳播進而污染到食品原料和動物飼料。真菌污染不僅可以造成腐敗變質而且有可能造成人和動物中毒，有些真菌毒素造成的危害是不可逆，甚至還有未知的毒害作用[1]。現代毒理學研究通常是在模式生物上進行試驗，得到數據和結果后經過一定的分析推及其至人體內的毒性作用。研究真菌毒素的模式生物中豬和大鼠最為常見，其次是肉雞和小鼠，另外還有魚類、馬、火雞和兔子，近些年出現果蠅和秀麗隱桿線蟲等無脊椎動物[2]。評價真菌毒素的毒理學評價試驗可歸納為：急性毒性試驗、亞急性毒性試驗、亞慢性毒性試驗、毒代動力學試驗和致畸試驗。運用傳統模式生物評價真菌毒素存在代謝情況比較復雜、繁殖周期過長和飼養條件與經濟成本較高等缺點。由此看出發展一種簡單、高效和成本低廉的評價真菌毒素的模式生物迫在眉睫。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，以下簡稱線蟲或C.elegans）作為模式生物始于20世紀60年代，英國科學家Sydney Brenner（Brenner S）發現了這種可以在土壤中自由生活的線蟲[3]，70年代中期，John Edward Sulston（Sulston J E）構建了完整的線蟲細胞譜系圖[4]，并與Brenner S合作完成了線蟲神經元的完整結構圖[5]，90年代末他們完成了線蟲的全基因測序，使線蟲成為基因組被完整測序的第一個動物。線蟲作為模式生物最初是應用于發育生物學和神經生物學領域，而今線蟲已經發展成為研究發育、壽命和環境毒理學等方面重要的模式生物[6]。

1 秀麗隱桿線蟲及真菌毒素簡介

1.1 秀麗隱桿線蟲

線蟲是一種可以生活在土壤中、個體微小的、以細菌為食的生物。成年線蟲呈蠕蟲狀，體長大概1.5 mm。線蟲身體全體通透，其表面有角質層包裹。線蟲有雄性與雌雄同體兩種性別，其中雌雄同體占99.8%，雌雄同體線蟲交配時尾部可由錐形變成扇形，一條雌雄同體線蟲與雄性線蟲交配可產生1 000多條后代，雌雄同體線蟲能產生大概300枚受精卵[7]。

1.2 真菌毒素

常見的真菌毒素有黃曲霉毒素B1（aflatoxin，AFB1）、赭曲霉毒素A（ochratoxins A，OTA）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）、T-2毒素以及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）等。這些真菌毒素對人和動物的危害包括致癌、致畸、致突變、生殖毒性、神經毒性和基因毒性等。鑒于真菌毒素的危害，我國制定了相關國家標準。幾種重要的真菌毒素及其生物學作用和中毒狀見表1[8]。

表1 重要的真菌毒素Table 1 Important mycotoxins

1.3 常用評價真菌毒素毒性的試驗方法

常用于評價真菌毒素毒性的試驗方法有急性毒性試驗、亞急性毒性試驗、亞慢性毒性試驗、慢性毒性試驗、致畸試驗和毒物動力學試驗，歸納如表2。

表2 常用評價真菌毒素毒性的試驗方法Table 2 Common methods of evaluating mycotoxin toxicity

2 應用線蟲評價真菌毒素的常用指標

2.1 致死率

應用線蟲研究真菌毒素常用的致死率指標參數包括 LC10、LC20和 LC50，分別代表 10%、20%和 50%受試模式生物死亡所需要的毒物濃度，其中以LC50最為常見。因致死率指標與其它指標存在相當大的關聯性，所以致死率指標常與其它評價指標共同使用[14]。Yang等[15]使用不同濃度的AFB1、DON、伏馬毒素B1（fumonisin B1，FB1）、T-2 毒素和 ZEA 處理野生型線蟲（N2）24 h，并計算它們的LC50，其試驗結果顯示這5種真菌毒素的LC50為：T-2毒素（1mg/L）＞AFB1（20mg/L）＞ZEA（76 mg/L）＞FB1（235 mg/L）＞DON（657 mg/L）。致死率評價指標分析過程簡易、效果顯著、試驗周期短，是利用線蟲評價真菌毒素毒性的基本評價指標。

2.2 個體發育與運動行為指標

個體發育指標通常包括體長、體寬和畸形指標，體長指標是在毒理學評價中最先使用的指標[16]，常結合體寬應用。研究中，一般將L4期的線蟲暴露一段時間，再通過Image-ProExpress software進行后續的分析[17-21]。Yang等[15]使用 L2 時期的野生型線蟲（N2）進行真菌毒素對線蟲個體發育影響的研究，線蟲染毒72 h，每24 h進行比較觀察，該研究表明受試線蟲在5種真菌毒素的作用下，線蟲的發育都表現出一定的劑量效應關系，隨著真菌毒素濃度的增加，其對線蟲形態發育的抑制也越明顯，且依據EC50來看，所用真菌毒素對線蟲發育影響的順序為：AFB1＞T-2毒素＞ZEA＞FB1＞DON。周鴻媛等[22]研究表明在 0～48 h 內：AFB1隨著暴露時間的增加，它對線蟲體長增長的抑制作用越強；DON隨著暴露時間的增加，它對線蟲體長增長的抑制作用越弱；ZEA在此水平上則無明顯區別。研究表明，各種真菌毒素除獨自具有毒性外，它們的聯合作用毒性危害更大，且在實際生活中造成的危害往往是多種真菌毒素聯合作用的結果，其聯合毒性主要表現在干擾蛋白質合成途徑、破壞機體免疫、引起氧化應激和發育生殖毒性等[23-30]。周鴻媛等[22]用AFB1、DON、和ZEA 3種真菌毒素通過不同的組合分為不同的混合真菌毒素，且設置高、中和低3個劑量組，將其染毒L2時期的野生型線蟲（N2）并測量體長，該研究表明AFB1+DON和AFB1+ZEA較單一暴露對線蟲體長的抑制作用增強，表現出協同作用；DON+ZEA較單一暴露對線蟲體長的抑制作用減弱，表現出拮抗；AFB1+DON+ZEA因濃度、時間等表現出不同的聯合毒性類型。體長反映發育速率，體寬反映發育速率和生理狀態，畸形暗示著高強度毒性的存在[31]。運動行為指標通常包括擺頭頻率、彎曲頻率、運動速率和基本運動能力，運動行為指標是反映線蟲神經系統的指標。運動行為指標具有操作簡易、效果直觀明了、周期短和成本低廉等優點。此外，咽泵運動、化學趨向性行為、消化能力和攝食也常用做分析線蟲代謝與運動的指標[32]。

2.3 生殖能力與壽命指標

生殖能力指標包括世代時間、后代數目與子宮內卵數目。世代時間反映繁殖速度，后代數目反映繁殖能力，子宮內卵數目反映繁殖能力與生理功能。楊振東等[33]利用ZEN對野生型線蟲（N2）進行親代染毒，后代斷毒。研究結果表明ZEN可對線蟲產生可傳遞的發育與生殖能力缺陷，發育的缺陷尚可在子代中得到部分恢復，生殖缺陷并沒有明顯恢復。首次證實了ZEN對線蟲發育與生殖能力點破壞是長期的，但這種親本與自帶之間的傳遞并不能簡單的認為是遺傳學上的“遺傳”，需進一步研究。壽命指標一般包括最長壽命和半致死天數，秀麗隱桿線蟲的壽命一般為25 d～30 d。有研究[34]發現 AFB1、DON、FB1、T-2 毒素和 ZEA 5 種真菌毒素均對線蟲的壽命有較大的影響，表現為縮短線蟲的最長壽命和半致死天數，依據線蟲壽命縮短的速度，得到這5種真菌毒素對線蟲壽命影響的排序為：T-2 毒素＞AFB1＞ZEA＞FB1＞DON。在該研究中：對照組線蟲最大壽命和最長半致死天數分別為29、12 d；劑量組線蟲最大壽命和最長半致死天數分別為13、6 d。由此可見真菌毒素對線蟲壽命具有很強的抑制作用。

3 真菌毒素對線蟲先天免疫信號通路的影響

線蟲最先在土壤中被發現，它可在土壤中健康的生存，土壤中含有多種微生物、重金屬和有毒化學物質等諸多不利因素[35]，所有動物都具有先進的先天免疫系統，以保護它們免受環境中的病原體的侵害[36]，線蟲也不例外，過去幾十年的研究表明這種防御機制的許多特征都是高等脊椎動物所共有的，線蟲的先天免疫信號通路主要有：胰島素／類胰島素生長因子-1（insulin/Insulin-like growth factory-1，IIS）、細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）、轉化生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）、絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）。這些通路在線蟲抗病原甚至對抗外界不良刺激等方面都起到了積極的調控作用，但有關真菌毒素如何影響這些調控通路的研究很少，現將有關研究進展進行歸納。

3.1 IIS途徑

Kenyon等[37]發現了能影響線蟲壽命的IIS途徑，此后IIS與線蟲生長發育與壽命之間關系的試驗越來越多。IIS對生物體生長、繁殖、新陳代謝乃至壽命是最重要生物調控通路之一，主要是通過DAF-16（其轉錄因子FOXO）同源物來實現的。Iser WB[38]首次提出了daf-2/IIS具有調控壽命的作用。有文獻報道[39]，外界不良環境、氧化應激、饑餓和熱刺激等都會對IIS通路產生抑制。還有研究者[40]提出IIS和FOXO還具有調節哺乳動物和線蟲神經元的作用，他們首次鑒定了野生型線蟲和IIS/FOXO突變型成年神經元轉錄組，IIS/FOXO神經元特異性靶點是IIS/daf-2突變體延長記憶所必需的，轉錄因子fkh-9在神經元中是daf-2突變體再生軸突所必需的，而在非神經元組織中daf-2是突變體延長壽命所必需的，他們的研究印證了Iser WB等的假設。Senchuk等[41]研究了3種線蟲線粒體突變（clk-1，isp-1和nuo-6）來研究其長壽途徑，發現受FOXO轉錄因子DAF-16調控的基因在所有3個突變體品系中均上調，并且這些線蟲中存在的轉錄變化與IIS途徑突變體daf-2明顯相同。且DAF-16和多個DAF-16相互作用蛋白（MATH-33，IMB-2，CST-1/2，BAR-1）對于所有3個線蟲線粒體突變體的維持正常壽命而言是必需的，這些突變體中DAF-16的活化是由ROS水平升高引起的，總的來說該研究揭示了3種線蟲線粒體突變體中長壽的重疊遺傳途徑，此結果與之前的研究相結合，證明DAF-16是多種長壽途徑中延長壽命的介質。

3.2 PCD途徑

程序性細胞死亡，通常稱為細胞凋亡，是多細胞生物生長發育過程中的重要過程，PCD的調控異常可能會導致機體疾病甚至癌癥、自身免疫病和視網膜變性等[42-43]，其過程見圖1。

圖1 PCD過程Fig.1 Process of PCD

線蟲是研究PCD的理想模式生物，因為線蟲的1090個體細胞中131個會發生PCD。促凋亡和促生存蛋白可能存在于大多數細胞中[44]，ced-9抑制凋亡，ced-3和ced-4促進凋亡，還有吞噬基因ced-1、ced-2、ced-5、ced-6、ced-7、ced-8 和 ced-10，細胞死亡通常在促凋亡基因egl-1的轉錄控制水平上進行，當產生EGL-1 BH3蛋白時，它破壞抗凋亡ced-9 Bcl-2蛋白和ced-4 Apaf-1樣蛋白之間的細胞保護作用，釋放ced-4激活促凋亡胱天蛋白酶ced-3[45]，從而促進凋亡。Feng等[46]將同期化的線蟲暴露在不同濃度的AFB1溶液中48 h，結果顯示當AFB1濃度為10 mol/L較對照組無差異，然而當濃度增至30 mol/L和90 mol/L時，線蟲體內凋亡基因會明顯增加，分析后發現在10和30暴露組中，AFB1在xpa-1突變株中比N2品系中更容易誘導PCD。

3.3 TGF-β途徑

TGF-β途徑是進化上高度保守的免疫防御途徑，在不良的環境條件下，線蟲可停止發育進入dauer階段，當環境條件改善時，它們會恢復發育并成年。調控線蟲進入或退出dauer的3條關鍵的信號傳導途徑為TGF-β、IIS和鳥苷酸環化酶途徑。該途徑是參與調控細胞生長、分化和死亡的重要信號通路之一，雖然線蟲中有 5種 TGF-β 相關配體（dbl-1、daf-7、unc-129、tig-2和tig-3），但只有兩種完整的TGF-β信號傳導通路被描述出來，分別是以daf-7和dbl-1為配體的Dauer pathway和Sma/Mad pathway。Dauer途徑中daf-7通過I型受體daf-1和II型受體daf-4發出信號，Sma/Mab途徑中dbl-1通過I型受體sma-6和II型受體daf-4發出信號。與人類一樣，線蟲通常在成年中期停止繁殖，線蟲平均生殖跨度約為3.5 d，而dbl-1突變線蟲的平均生殖跨度為7 d以上，dbl-1途徑通常限制生殖跨度并促進及時停止生殖，從機理上講，DBL-1途徑通過調節種系和卵母細胞的質量來調節生殖衰老[47]。

3.4 MAPK途徑

線蟲秀早已被確定在先天免疫上具有保守的機制[48]。哺乳動物中3條高度保守的MAPK信號通路分別是：細胞因子抑制的抗炎藥物結合蛋白激酶（cytokine-suppressive anti-inflammatory drug-binding protein kinase，p38 MAPK）、細胞外信號調節激酶（extra－cellular signal-regulated kinases，ERK MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK MAPK），這3條信號通路分別對應線蟲中的PMK-1、MPK-1和KGB-1。Yang等[49]首次在DON的暴露下觀察到胃上皮細胞（GES-1）中ROS快速增加，同時觀察到線粒體DNA損傷、呼吸鏈受損、耗氧率降低、G2/M細胞周期停滯和細胞凋亡，經分析發現FOXO3a是關鍵轉錄因子，能調節與線粒體DNA損傷和細胞損傷相關的凋亡基因。此外，敲除FOXO3a可降低DON對GES-1的毒性，FOXO3a通過ROS/JNK/FOXO3a起著關鍵作用，作為DON誘導的細胞毒性的負調節劑。有研究[50]將處于 L2時期的線蟲暴露于 125、250、500 μg/mL DON 中24 h，暴露于250、500 μg/mL DON會使線蟲的存活率從100%降低至95%，而暴露于125 μg/mL DON中則沒有影響。盡管對L2期線蟲的生存能力影響很小，但暴露于DON會導致線蟲繁殖力明顯降低，DON暴露24 h可使后線蟲產卵的數量分別減少36.7%，72.0%和92.7%。RT-qPCR分析表明DON顯著上調了C17H12.8，K08D8.5和 F35E12.5的 mRNA 水平，而C17H12.8和K08D8.5正是編碼 PMK-1的基因，RNAseq分析表明C17H12.8和K08D8.5基因表達分別增加了32.4倍和2倍。

4 總結與展望

真菌毒素作為危害糧食安全的重要因素，近些年越來越受到研究者的重視，據PubMed數據庫數據，自2010年開始公開發表的關于真菌毒素的科研文章開始迅速增長。此前研究真菌毒素毒性的模式生物主要是豬、大鼠和雞等動物，這些模式生物大都存在生命周期較長、生理結構復雜、飼養環境要求苛刻、不易實驗室研究等困難。自上個世紀90年代開始，研究者把秀麗隱桿線蟲應用到模式生物毒理學中來，利用線蟲評價重金屬、農藥和化學材料等外源毒物的毒性。不計其數的研究證實秀麗隱桿線蟲是理想的毒理學評價模式生物，其擁有全身透明、結構簡單、生長繁殖速度快、周期短、與人類基因相似度高和可實驗室培養等不可替代的優點。近幾年，研究者才開始利用秀麗隱桿線蟲研究真菌毒素，研究者利用發育、運動、致死率、生殖能力和壽命等指標證實了真菌毒素可顯著抑制線蟲的生長發育，減短壽命，減少后代數目和降低后代質量，其對線蟲表現出“三致”毒性。這些是與之前利用其他模式生物研究真菌毒素的結果相符合的。雖然將線蟲應用到環境評價和生態毒理學領域已有將近30年的歷史，但近幾年才初步構建以秀麗隱桿線蟲為模式生物評價真菌毒素的體系。但在實驗室條件下，線蟲的應用仍存在以下問題：（1）液體試驗中線蟲數量難以控制；（2）運動行為指標在判斷時具有很大的主觀性；（3）各階段線蟲敏感性差異；（4）試驗過程中各生物化學抑制劑對線蟲本身的影響；（5）各信號通路間的交聯作用不清晰。起步晚、發展快是基于線蟲的真菌毒素研究的特點，對于真菌毒素如何影響線蟲的IS、PCD、TGF-β和MAPK等通路的機制研究資料相當缺乏，這是研究者未來工作的焦點，在后續的研究中也應著重研究這些通路之間的相互作用。