不同作物間作對烤煙根際土壤細菌群落組成及功能的影響

張開虹， 桑維鈞， 何世芳， 袁清婷， 徐敏菊

(貴州大學 煙草學院， 貴州 貴陽 550025)

植物根系與土壤發生相互作用緊密的微域環境，稱之為根際環境(Rhizosphere)，包括碳水化合物、氨基酸以及生長物質等諸多成分，是植物在生長、吸收及分泌過程中形成的物理、化學、生物學性質不同于土體的復雜動態微型生態系統。土壤微生物作為土壤環境的重要組成部分，會形成各種有機酸、激素、抗生素、醇和維生素等多種產物，從而影響土壤養分的供應狀況，改變植物根際土壤營養和氧化還原條件等，在土壤養分和有機質的轉化與增加過程中發揮著重要作用，進而對植物的生長發育及產質量產生影響[1]。土壤微生物的種類、數目及活性可宏觀且真實地反映土壤的營養狀況[2]。土壤微生物區系失衡和多樣性是土壤傳播植物病害的潛在原因[3]。優良健康的根際環境是農作物生長的重要基礎，了解根際土壤微生物群落結構組成的多樣性及其影響因素對農作物生長及污染土地修復等都具有重要意義。

利用植物與微生物互作提高資源利用，減少農藥和化肥的投入是農業綠色發展的重要內容之一。大量研究表明，間套作和輪作模式中作物通過直接或間接作用改變土壤環境，能夠使植物充分利用水分和養分、抑制雜草滋生和控制病蟲害等[4-8]。但目前有關烤煙種植土壤微的生物區系，尤其是間套作條件下的烤煙根際土壤微生物環境的研究較少。一直以來，在實際生產上烤煙套作甘薯的種植方法已很普遍[9]。有研究表明，烤煙套作甘薯不僅可一定程度上改善煙葉的內在品質，顯著提高烤煙煙葉總糖含量、還原糖含量和糖堿比，降低氯含量[10]，還能在病蟲害防治方面減輕烤煙病毒病、角斑病和野火病的危害[11-12]。而間作甘薯是否也能夠具有相似效果還缺乏研究。丹參是一種唇形科藥用植物，在全國大部分地區都有分布，是世界公認的治療心腦血管病的首選藥物之一[13]，與大多數作物一樣在栽培過程中存在連作障礙，但其與烤煙間作效果如何未見研究報道。利用豆科作物與根瘤菌共生產生的固氮作用，豆科與非豆科作物間套作也是傳統間套作的重要種植模式之一。蠶豆與玉米間作能夠提高玉米對養分的吸收量及其產量[14-16]，鮮見該模式在烤煙上的研究報道。為此，以單作烤煙為對照，選擇甘薯〔Ipomoeabatatas(L.) Lam.〕、丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)和大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕3種不同類型作物，研究3種不同作物與烤煙間作對根際土壤細菌群落組成及功能的影響，以期為連作障礙的生態調控提供技術支撐。

1材料與方法

1.1試驗地概況

試驗于2018年4-8月在貴州省遵義市綏陽縣蒲場煙草科技示范園(107°08′E,27°89′N)進行，該地屬亞熱帶濕潤季風氣候，年平均降雨量在900～1 250 mm，無霜期280 d左右。

1.2材料

1.2.1烤煙品種云煙87，當地生產上的主栽品種。

1.2.2土壤樣品共計48份，采自烤煙-甘薯、烤煙-丹參(B)、烤煙-大豆和單作烤煙(CK)4個處理的烤煙根際的土壤，每個處理12份。

1.3方法

1.3.1試驗設計間作共設4個處理：單作烤煙為對照(CK)；A，烤煙-甘薯；B，烤煙-丹參；C，烤煙-大豆。3次重復，共12個小區，均勻輪替分布。烤煙間距50 cm，烤煙移栽后10 d間作甘薯、丹參和大豆。甘薯與丹參采用移栽種植，大豆在3 cm土層穴播，每穴播種3～4粒，間作作物與煙株均間隔15 cm左右(圖1)。試驗期間除草灌溉、病蟲害防治等管理措施按常規方法進行。

Fig.1 Schematic layout of tobacco intercropped withI.batatas,S.miltiorrhizaandG.max

1.3.2樣品采集烤煙于移栽后的第10天與甘薯、丹參和大豆間作，分別于還苗期(T1)、伸根期(T2)、旺長期(T3)和成熟期(T4)采集4個間作處理的烤煙根際土壤。T1為間作當天第1次采集土樣的時期(還苗期),以后每隔25 d采樣1次，即T2、T3和T4對應烤煙的生育期分別為伸根期、旺長期和成熟期。

每個小區隨機選取4株烤煙連根拔起，抖掉周圍土壤，將每個重復的根際土壤用毛刷分別刷入滅菌袋內，將相同小區土樣混合。將采得土樣放置干冰盒中，帶回實驗室于-80℃保存，用于后續DNA提取。

1.3.3土壤DNA提取與測序采用CTAB法提取樣本的基因組DNA，然后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模版，采用16S rRNA基因中的V3～V4區引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)進行擴增。PCR擴增條件：98℃預變性1 min，98℃變性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個循環，然后再在72℃延伸5 min。PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后再次進行瓊脂糖凝膠電泳確認，再用GeneJET膠回收試劑盒(Thermo Scientific)剪切回收目標條帶。高通量測序基于半導體芯片技術的IonS5TMXL測序平臺，測序深度為每個文庫原始讀數(reads)不少于4萬條，由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3.4數據處理與分析

1) 樣品有效序列的獲取。初始數據按照Barcode序列和PCR擴增引物序列拆分出各樣品數據，將Barcode序列和引物序列截去后，經FLASH對每個樣品的讀數進行拼接，獲得原始數據(Raw Data)，然后參照QIIME對原始數據進行拼接過濾后得到有效數據(Clean Data)。

2) 樣品有效序列的可分類單元(OTUs)聚類。使用UPARSE將有效數據以97%相似性(Identity)為依據進行可分類單元(OTUs)聚類，每個OUT代表1個物種。

3) 細菌的群落多樣性。采用R軟件繪制稀釋曲線反映土壤樣品中的細菌信息，依據聚類結果再用QIIME進行Alpha多樣性計算分析和對每個OTU的代表序列進行物種注釋，得到相應的物種信息和相對豐度分布情況。采用群落豐富度Ace指數和Chao1指數以及群落多樣性香農指數(Shannon)和辛普森指數(Simpson)進行評估，以平均覆蓋度(Goods coverage)反映測序深度。

4) 細菌代謝功能的預測。Tax4Fun是基于16S Silva數據庫的用于腸道、土壤等環節樣品功能預測的R程序包，利用其對基于細菌群落16S rRNA的代謝功能進行預測。

2結果與分析

2.1樣品有效數據信息的可分類單元(OTUs)聚類

不同作物間作烤煙根際土壤48份樣品16s RNA的V3～V4區測序結果顯示，共獲得3 667 900條有效序列，平均每個樣品得到76 415條有效序列，質控有效率達93.77%。有效序列以97%的一致性將可分類單元(OTUs)聚類共得到6584個OTUs。測序深度可全面覆蓋土壤樣品中絕大多數的細菌信息，能夠較好地反映烤煙根際土壤樣品中細菌的群落多樣性。

2.2細菌的Alpha多樣性

從表1可知，隨著烤煙生長發育進程的延長，不同作物間作烤煙根際土壤細菌群落的豐富度、多樣性和平均覆蓋度的變化。豐富度：A、B、C、CK的Ace指數分別為T2>T4>T3>T1、T3>T2>T4>T1、T2>T3>T4>T1和T3>T4>T2>T1，Chao1指數分別為T2>T4>T3>T1、T3>T4>T2>T1、T2>T3>T4>T1和T3>T4>T1>T2。多樣性：A、B、C、CK的香農指數分別為T4>T2>T3>T1、T4>T3>T2>T1、T4>T2>T3>T1和T2>T4>T3>T1，辛普森指數分別為T2=T3>T1=T4、T2=T3=T4>T1、T2=T4>T3>T1和T2=T3=T4>T1。平均覆蓋度：A、B、C、CK分別為T1>T3>T4>T2、T1>T4>T2>T3、T1>T4>T3>T2和T2>T1>T4>T3。其中，細菌的豐富度Chao1指數，T2與T1比，CK下降3.74%，A、B和C分別上升20.22%、6.65%和23.79%；T3與T2比，B和CK分別上升4.49%和8.53%，A和C分別下降11.96%和2.91%；T4與T3比，A上升9.55%，B、C和CK分別下降4.16%、0.91%和2.55%。細菌的群落多樣性，T2與T1比，各處理土樣細菌的群落多樣性均呈上升趨勢，C上升幅度最大，為5.32%；T3與T2比，A、C和CK的細菌群落多樣性均呈小幅下降趨勢，B上升0.30%；T4與T3比，細菌群落多樣性均呈上升趨勢。

表1 不同作物間作烤煙根際土壤細菌的Alpha多樣性

2.3細菌的群落結構

從不同作物間作烤煙根際土壤得到的6 584個OTUs序列進行物種注釋，共有2 480(37.67%)個OTU注釋到屬水平。根據注釋結果統計分析，48個土壤樣品共檢測到50個門、58個綱、130個目、237個科和574個屬。

從圖2看出，在門水平上相對豐度列前10位的物種包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，為烤煙根際土壤的主要細菌類群(平均豐度>5%)，高于其他優勢菌群，約占總菌群的83.90%，并在烤煙各個生長時期平均豐度均較高。其中，變形菌門的相對豐度在各處理中都隨烤煙生長發育時期而降低，至T3降至最低，T4上升，各處理無明顯差異；放線菌門的相對豐度 A、B和C都呈波動式變化，T2降至最低、T3升至最高、T4又下降；CK則為T2和T3上升，T4下降，且T3的放線菌門的相對豐度最高；酸桿菌門的相對豐度雖然CK、A和C均為T2升至最高后下降，B至T3升至最高后下降，但各時期酸桿菌門的相對豐度在各處理中的差異不大；擬桿菌門的相對豐度CK隨烤煙生長發育呈逐漸降低趨勢，A、B和C都在T2達最高，T3呈降低趨勢，T3的降低更明顯，T4的A和C持續降低，但B呈上升趨勢。

從圖3看出，不同作物間作烤煙根際土壤樣本在屬水平上豐度列前15位的物種中，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、溶桿菌屬(Lysobacter)、鞘脂菌屬(Sphingobium)、未分類的甲烷球菌類(unidentifiedGammaproteobacteri)、Haliangium、Devosia、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、馬賽菌屬(Massilia)，未分類的酸桿菌類(unidentifiedAcidobacteria)為優勢菌屬(相對豐度>1%)。

2.4細菌功能的預測

經Tax4Fun對不同作物間作烤煙根際土壤細菌群落16S rRNA的代謝功能預測結果表明，在一級功能層共獲得代謝(Metabolism)、遺傳信息處理(Genetic information processing)、環境信息處理(Environmental information processing)、細胞過程(Cellular processes)、人類疾病(Human diseases)和有機系統(Organismal systems)六類生物代謝通路功能。其中，屬水平上位列前15細菌的代謝、遺傳信息處理和環境信息處理為其功能預測主要組成，分別占47.22%～48.14%、19.82%～20.78%和13.40%～14.48%。隨烤煙生長發育，代謝、遺傳信息處理和有機系統占比逐漸上升，T3升至最高，T4下降，環境信息處理和人類疾病與此相反，隨烤煙生育時期占比逐漸降低，T3降至最低，T4上升，細胞過程占比呈波動式變化，T2和T4呈上升趨勢，T3呈下降趨勢。從圖4看出，二級功能層由44個子功能組成，其中包括碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、膜運輸(Membrane transport)、翻譯(Translation)、復制和修復(Replication and repair)、能量代謝(Energy metabolism)、信號轉導(Signal transduction)、脂質代謝(Lipid metabolism)、輔助因子與維生素的代謝(Metabolism of cofactors and vitamins)和核苷酸代謝(Nucleotide metabolism)等。

3結論與討論

土壤微生物作為農業生態系統中重要的組成部分，對維持生態系統平衡起著重要作用。早期對土壤微生物的研究受技術限制，依賴于人工分離培養技術，然而土壤中絕大多數微生物無法在實驗室條件下分離存活。高通測序技術的發展，可同時對多種微生物基因組進行測序，相較于傳統的分離培養方法有助于更好地深入研究微生物與作物生長發育之間的關系，為克服連作障礙提供數據支撐[17]。隨著下一代測序技術的迅速發展與普及，16S rDNA擴增子測序技術被認為是土壤微生物多樣性研究較好的方法之一。基于半導體芯片技術的IonS5TMXL高通量測序已成為研究環境樣品中微生物群落組成結構及多樣性的重要手段。通過IonS5TMXL高通量測序技術，研究間作甘薯、丹參和大豆條件下的烤煙根際土壤細菌群落的結構及多樣性，探討幾種栽培措施對烤煙根際土壤細菌群落結構及多樣性的影響。共獲得3 667 900條有效序列，平均測序深度達76 415條有效數據，不同作物間作烤煙根際土壤均達96%以上，平均覆蓋度達97.25%。表明，測序結果可反應樣本的真實情況，該方法也可在包括烤煙在內的許多農作物領域應用。經Alpha多樣性分析，不同作物間作烤煙根際土壤具有豐富的群落組成。烤煙不同生長發育階段的根際土壤細菌群落豐富度和多樣性存在一定的差異性，均在旺長期達最高，與前人的研究結果一致[18]。間作處理細菌群落豐富度高于單作烤煙處理(對照)，細菌群落多樣性低于對照，與涂勇等[19]研究結果基本一致。

不同作物間作烤煙根際土壤樣本在屬水平上豐度位列前15的物種中，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、溶桿菌屬(Lysobacter)、鞘脂菌屬(Sphingobium)、未分類的甲烷球菌類(unidentifiedGammaproteobacteri)、Haliangium(屬)、Devosia(屬)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、馬賽菌屬(Massilia)，未分類的酸桿菌類(unidentifiedAcidobacteria)為優勢菌屬(相對豐度>1%)，與前人[20]研究結果相近。在門水平上，間作相較單作烤煙根際土壤微生物放線菌門的相對豐度降低，變形菌門和擬桿菌門的相對豐度提高。在屬水平上，間作烤煙際土壤Devosia、Rhodanobacter、假單胞菌屬(Pseudomonas)和節桿菌屬(Arthrobacter)相對豐度降低，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、鞘脂菌屬(Sphingobium)和未分類門的甲烷球菌的相對豐度提高。表明間作一定程度上改變了烤煙根際土壤微生物的群落結構。

在相同環境條件下，微生物群落的功能相似，但行使功能的微生物組成可能存在很大差異。表明，外界環境因子與土壤中微生物群落的功能組成之間的相關度大于外界環境因子與群落組成之間的相關度。所以，在分析土壤環境與微生物群落組成的基礎上對揭示微生物群落的功能顯得尤為重要。齊澤明等[21-23]研究發現，植物根系在植株生長發育過程中不斷向周圍釋放大量的分泌物，這些次生代謝產物會改變根際環境，導致土壤微生物區系發生變化，并受植物生長發育階段的影響。從采集到的土壤樣品基于細菌群落16s RNA功能預測發現，隨著烤煙生長發育進程的推進，行使代謝、遺傳信息處理和有機系統的功能基因逐漸上升，在烤煙旺長期達最高，成熟期降低；環境信息處理和人類疾病與此相反，隨烤煙生育時期逐漸降低，旺長期達最低，成熟期上升；細胞過程占比呈波動式變化，伸根期和成熟期上升，旺長期下降。推測：可能與烤煙根系在各生育時期的分泌物差異有關。間作處理中，行使代謝功能類別中編碼萜類化合物、聚酮類化合物、異生素生物降解、脂質代謝和氨基酸代謝的功能基因減少；編碼酶家族和糖的生物合成和代謝的功能基因有少量增加；行使遺傳信息處理功能類別中編碼翻譯、折疊、分類和降解的功能基因減少；行使環境信息處理功能類別中編碼細胞膜運輸的功能基因增加；行使細胞過程類別中編碼細胞運動的功能基因增加。可能是因為間作作物根系分泌的次生代謝產物導致周圍土壤環境發生變化，即改變了烤煙根際土壤的微生物區系，從而影響根際土壤微生物群落的功能。此外，間作處理下烤煙根際群落結構及其功能隨著生育期的推進，與單作烤煙根際群落結構及其功能變化趨同。說明，與間作因素相比，烤煙的生育期是影響根際群落結構及功能的主要因素。

研究結果基本揭示了烤煙與甘薯、丹參和大豆間作土壤細菌的多樣性及其功能的變化，可為今后研究烤煙連作障礙提供參考，但由于研究中稀釋曲線即測序深度并未達到飽和，處理中也還有部分細菌種群未被發現。因此，研究結果僅能代表各個土樣中的大部分細菌種群，更深層次的研究仍有待開展。