楊樹ERF11轉錄因子基因應答滲透脅迫表達分析

劉 悅 趙 凱 呂冠斌 姜廷波 周博如

(東北林業大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

AP2/ERF基因家族是植物所特有的、最大的轉錄因子家族之一，該家族轉錄因子參與植物的多種生物學過程，包括植物的生長、花發育、果實發育、種子發育、損傷、病菌防御、高鹽、干旱等環境脅迫響應等[1～4]。根據AP2/ERF結構域的數目和特點，AP2/ERF轉錄因子家族分為AP2亞家族、EREBP亞家族以及RAV亞家族[5]。ERF類轉錄因子的AP2/ERF結構域N-端是由高度保守的19～20個堿性YRG基元組成的YRG區，C-端是由含有42～43個氨基酸殘基組成的RAYD區。AP2/ERF基因家族可以通過結合脫水應答元件DRE和CRT應答干旱、低溫、高鹽脅迫[6]，通過與GCC-box及誘導元件結合應答脅迫[7]。近年來，越來越多的研究表明AP2/ERF家族基因參與到了植物的生物、非生物脅迫[8～11]。研究表明毛果楊PtrDREB28基因能夠增強植物對低溫和高溫的耐受能力[12]。轉錄因子ERF76基因能夠提高小黑楊的耐鹽能力[13]。ERF11轉錄因子屬于EREBP亞家族成員之一，研究表明ERF11基因通過激活赤霉素生物合成、刺激信號傳導促進節間生長[14]；在擬南芥(Arabidopsis)中，乙烯反應因子ERF6和ERF11對甘露醇誘導的擬南芥生長抑制有抗拮作用[15]；在白樺(Betulaplatyphylla)中，ERF11基因響應高鹽干旱脅迫[16]；ERF11基因激活BT4轉錄，調節丁香假單胞菌免疫[17]，但ERF11基因功能未在楊樹中有相關報道。為探明小黑楊ERF11基因應答高鹽及干旱兩種脅迫的表達特點，本研究用RT-PCR從小黑楊(Populussimonii×P.nigra)葉片中克隆了ERF11基因cDNA片段，對ERF11基因進行生物信息學分析，用RT-qPCR分析了ERF11基因在NaCl、甘露醇模擬干旱脅迫條件下的表達特性，為探明ERF11基因在楊樹抗逆中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

植物材料為培養1個月的同一無性系雙單倍體小黑楊組培苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的基因的克隆

利用天恩澤柱式植物RNAout試劑盒提取總RNA，用PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒反轉錄成cDNA。設計引物(見表1)，對其克隆，按照擴增反應程序：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環，72℃延伸10 min，4℃保存。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳回收，與pMD19-T載體連接，42℃熱激轉化大腸桿菌，挑選陽性克隆送至生工測序，保留測序正確的菌液進行后續實驗。

1.2.2 生物信息學分析

ExPasy(http://web.expasy.org/protparam/)在線Protparam軟件分析ERF11氨基酸的理化性質。ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)的Kyte and Doolittle算法分析ERF11蛋白的親水/疏水性。Singa-P(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)的神經網絡算法對ERF11

表1 實驗引物設計

蛋白進行分析并預測其信號肽。TMPred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html#opennewwindow)預測ERF11蛋白的跨膜結構。SOMPA(npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma)分析ERF11蛋白的二級結構。Swissmode(https://swissmodel.expasy.org/interactive)分析ERF11蛋白的三級結構。利用NCBI數據庫Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)對ERF11基因序列蛋白進行同源序列比對，并利用MEGA(Version 5.2)構建進化樹。用在線預測軟件Yloc(http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/YLoc/webloc.cgi)進行亞細胞定位預測分析[13]。

1.2.3PBI121-ERF11-GFP植物表達載體構建

根據載體PBI121-GUS與目的基因ERF11序列設計含SpeⅠ和XbaⅠ酶切位點的酶切引物(見表1)，對其克隆，擴增反應程序與目的基因克隆相同。于37℃雙酶切反應4 h后瓊脂糖凝膠回收，利用T4DNA連接酶將純化后的PBI121酶切產物和ERF11酶切產物進行連接，將連接產物轉至大腸桿菌TOP10感受態中，利用載體引物和ERF11基因特異性引物進行菌液PCR檢測，并將陽性克隆菌液送去測序。

1.2.4 基因槍法瞬時轉化

利用基因槍法瞬時轉化ERF11-GFP融合蛋白，具體操作根據PDS-1000臺式基因槍使用說明。暗培養36～72 h后，在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。

1.2.5 脅迫下處理表達分析

將小黑楊組培苗置于相對濕度60%～70%、14 h光/10 h暗、平均溫度25℃條件下土培1個月后，將材料分為42組，每3組進行同一處理。分別用水(對照組)、0.15 mol·L-1NaCl和200 mmol·L-1甘露醇處理0、3、6、9、12和24 h后，分別將樣本的根、莖、葉保存至-80℃。

利用柱式植物RNA提取試劑盒提取植物總RNA，RT-PCR反轉錄成cDNA。將cDNA用無菌的ddH2O稀釋100倍，作為實時熒光定量PCR的模板，熒光定量試劑盒為SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)。BLAST分析預測該基因保守結構域，并設計實時熒光定量PCR引物(見表1)。PCR在ABI7500熒光PCR儀上進行。以內參基因ACT為對照，用2-ΔΔCT計算法計算其相對表達量。

2 結果

2.1 ERF11基因克隆及氨基酸理化性質分析

從小黑楊模板cDNA中克隆獲得ERF11基因，該基因全長732 bp，編碼243個氨基酸，含20種氨基酸(見圖1)，具完整的開放閱讀框。ERF11蛋白的化學式為C1132H1757N347O361S9，等電點(PI)為9.01，不穩定系數為50.12，屬于不穩定蛋白。ERF11蛋白總平均疏水指數為-0.876，親水性區域分布均勻，氨基酸數量較多，為親水蛋白(見圖2)。利用在線軟件SOPMA對楊樹ERF11蛋白的氨基酸序列進行二級結構預測，結果表明該蛋白主要由無規則卷曲、延伸鏈、α-螺旋、β-折疊組成(見表2)。

表2 ERF11蛋白的二級結構

2.2 信號肽及跨膜結構域預測

信號肽是N端的引導新合成的蛋白質向分泌通路轉移的一段氨基酸序列，通常由20～30個氨基酸殘基組成。信號肽預測結果表明，ERF11不存在信號肽(見圖3)。跨膜結構是一段一般由20個左右的疏水性氨基酸組成的片段，主要形成ɑ-螺旋。根據在線工具TMPred預測ERF11的跨膜結構，該基因蛋白不存在跨膜結構(見圖4)。

圖1 ERF11蛋白編碼氨基酸含量Fig.1 Secondary structure of ERF11 protein

圖2 ERF11蛋白氨基酸親疏水性區域分布圖Fig.2 Distribution map of amino acids of ERF11 protein

圖3 小黑楊ERF11蛋白信號肽預測Fig.3 Prediction of ERF11 protein signaling peptide in Populus simonii×P.nigra

圖4 小黑楊ERF11蛋白跨膜結構預測和分析Fig.4 Prediction and analysis of ERF11 protein transmembrane structure in Populus simonii×P.nigra

2.3 同源性分析

對ERF11氨基酸序列進行同源序列比對，并構建系統進化樹(見圖5)。結果表明，17條蛋白序列大致可分為兩類：其中綠豆(Vignaradiatavar.radiata)、威氏大豆(Glycine)、赤豆(Vignaangularis)、花蕓豆(Phaseolusvulgaris)、木瓜(Caricapapaya)、枇杷樹(Eriobotryajaponica)、蘋果(Malusdomestica)、哥倫比亞錦葵(Herraniaumbratica)、橙子(Citrussinensis)、克萊門柚(Citrusclementina)聚成一個大類，與小黑楊ERF11基因親緣關系較遠；小黑楊(Populussimonii×P.nigra)、毛果楊(Populustrichocarpa)、胡楊(Euphratica)、蓖麻(Ricinuscommunis)、橡膠樹(Heveabrasiliensis)、麻瘋樹(Jatrophacurcas)、木薯(Manihotesculenta)聚成一類，且親緣關系較近。

圖5 小黑楊ERF11系統進化樹Fig.5 Evolutionary tree of PsnERF11

圖6 ERF11蛋白亞細胞定位結果 A,D.暗場觀察；B,E.明場觀察；C,F.二者結合效果Fig.6 Subcellular localization of ERF11 protein A,D.Were observed in dark filed for green fluorescence；B,E.Were observed in bright field; C,F.Were observed in combination

2.4 基因在洋蔥表皮的瞬時表達

ERF11融合表達載體使用載體引物進行驗證，載體引物位于35 s啟動子及GFP序列兩端，條帶為1 800 bp左右，表明載體構建成功。激光共聚焦顯微鏡下觀察(見圖6)，對照GFP空載體在整個洋蔥表皮細胞中均有表達，而ERF11-GFP融合表達載體只能在細胞核中看到綠色熒光，ERF11基因在細胞核中表達，與在線預測軟件Yloc預測分析結果一致。

2.5 ERF11基因差異表達分析

ERF11基因表達具有組織特異性，并受脅迫誘導表達。在非脅迫條件下，其在根中表達水平明顯比在莖和葉中的表達水平高，約為莖和葉中表達水平的4.7倍，而在莖和葉中的表達水平差異不大(見圖7)。甘露醇脅迫下，ERF11基因在根莖葉中的表達量均有先升高再降低的趨勢，根中24 h達到最大值，約為非脅迫對照表達水平的163.7倍；莖中12 h達到最大，約為非脅迫對照表達水平的4.9倍；在葉中9 h表達量達到最大值，為非脅迫對照表達水平的6.8倍(見圖8)。鹽脅迫下，ERF11基因在根莖葉中的表達同樣表現出先升高后降低的趨勢，根中12 h表達量達到最大，約為非脅迫對照表達水平的59.8倍，莖中9 h達到最大，約為非脅迫對照表達水平的2.4倍，葉中3 h達到最大，約為非脅迫對照表達水平的的4.8倍(見圖9)。

圖7 小黑楊ERF11基因0 h時不同部位相對表達量變化Fig.7 Changes of relative expression of ERF11 gene in different parts of Populus simonii×P.nigra at 0 h

圖8 小黑楊ERF11基因甘露醇模擬干旱處理下不同時間下不同部位相對表達量變化 a.根；b.莖；c.葉Fig.8 Changes of relative expression of ERF11 gene in different parts of Populus simonii×P.nigra under simulated drought a.Root; b.Stem; c.Leaf

圖9 小黑楊ERF11基因鹽脅迫處理下不同時間下不同部位相對表達量變化 a.根；b.莖；c.葉Fig.9 Changes of relative expression of ERF11 gene in different parts of Populus simonii×P.nigra under salt stress at different time a.Root; b.Stem; c.Leaf

3 討論

轉錄因子也稱反式作用因子，是一種可被真核生物基因啟動子序列中的順式作用元件識別，并能特異性結合的一類蛋白[18]。在植物的生長發育過程中，會受到各種生物、非生物脅迫，通過信號傳遞促使轉錄因子與下游順式作用元件結合，調控下游基因表達，對逆境做出響應，使植物對環境脅迫的適應能力增強。由不同轉錄因子組成的調控網絡在抵御逆境脅迫中發揮了重要的作用[19]。

植物在受到外界逆境環境脅迫時，通過信號傳遞，使轉錄因子與下游基因的順式作用元件相結合調控下游基因，進而調控植物響應外界逆境環境，而轉錄調控已成為植物對逆境脅迫反應調控中的研究熱點[20～21]。滲透脅迫會導致植株水分向外倒流，引起生理干旱、細胞的滲透勢增加、氣孔導度下降及葉綠體受損，影響植物蒸騰作用，抑制植物生長甚至死亡[22～23]。AP2/ERF家族轉錄因子在調節植物生物、非生物脅迫中發揮著重要的作用[24～25]。迄今為止，已報道的ERF家族基因多數被低溫、干旱、鹽堿、病害、機械損傷等逆境或脫落酸(ABA)、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)等內源激素誘導，參與不同的信號調節途徑。此外，研究發現，不同逆境環境、不同激素誘導的ERF家族成員也不同。擬南芥ERF1轉錄因子通過GCC-box和DRE元件結合應答干旱和高鹽脅迫[26]。小麥轉錄因子TaERF3基因的過表達植株抗旱、耐鹽能力顯著增加[27]。水稻OsEBP-89基因表達受到高鹽和2,4-D的調控[28]。番茄TSRF1基因可被乙烯、水楊酸以及病害誘導、SLERF5基因則響應高鹽和干旱脅迫[29～31]。AgDREB1和AgDREB2可能作為轉錄激活因子通過結合相應的DRE來調節下游基因，從而增強芹菜的抗應激能力[32]。

本研究中，從小黑楊葉中克隆出732 bp的ERF11基因，對該基因進行了生物信息學分析、親緣關系分析、亞細胞定位、時空表達分析。ERF11基因在應答高鹽干旱脅迫上具有明顯的組織特異性，在根中的相對表達量遠高于莖和葉。楊樹ERF11基因可能參與植物滲透脅迫，與增強植物抗逆性有關。