紅松查爾酮合成酶基因CHS密碼子偏好性分析

李 翔 范作義 王井源 王 淇 李喜鵬 王德秋孔令遠 曹森林 孟慶剛 趙曦陽*

(1.林木遺傳育種國家重點實驗室,東北林業大學林學院,哈爾濱 150040； 2.吉林省臨江林業局,臨江 134600)

在生物體內，三聯體密碼子是由信使RNA分子中四個堿基組成3個核苷酸形成的，編碼一個特定的氨基酸，進行遺傳信息的傳遞。一般地，密碼子存在簡并性，即每個特定的氨基酸可對應1～6種密碼子[1]。在生物的長期進化過程中，由于受到自然選擇壓力、變異和突變的影響，不同生物體在編碼氨基酸時并不是完全隨機選擇密碼子，而是對某些特定的同義密碼子存在一定的使用偏好性，即存在密碼子使用偏好性現象(codon bias)，該現象在自然界中普遍存在。目前，在細菌、哺乳動物和植物等多個物種中，均觀察到明顯的密碼子使用偏好性現象[2]。密碼子偏好性不但可以影響蛋白質翻譯的速度和折疊，還可以影響mRNA水平的轉錄調控及外源基因的表達量[3～4]。前人研究發現，在大量組織中普遍表達且表達水平相對恒定的基因的表達量與密碼子使用偏好性存在較強的相關性，這些基因受到了明顯的翻譯選擇作用[5]。另外，不同物種、不同生物體的基因、基因家族或基因組密碼子在使用上存在很大的差異，對功能基因的翻譯調控產生重要的影響[6～7]，進而會影響基因的功能。即使在一個基因內，密碼子的使用偏好性也會有很大的差異。因此，分析同義密碼子的使用偏好性將有助于揭示物種的起源和分子進化規律，提高翻譯的準確性和效率，為研究生物體進化、基因功能、蛋白質結構，提高外源基因的表達量提供了重要信息，同時，可利用編碼區和非編碼區的基因組特征差異進行全基因組掃描，發現新基因，對研究基因功能和蛋白質功能具有重要的參考價值[8]。

目前，關于密碼子使用偏好性的研究表明，密碼子偏好性是通過選擇、突變和遺傳漂變之間的平衡來維持的。密碼子偏好性可能與3個原因有關，一是避免轉錄終止，影響基因表達，二是密碼子與反密碼子的相互作用強度適中，有利于蛋白質生物合成的迅速進行，三是密碼子偏好性可提高翻譯效率，增加細胞內tRNA的含量。此外，密碼子偏好性受其他因素影響，如基因的堿基組成、GC含量、基因長度、表達水平、蛋白質親水性、蛋白質二級結構、表達水平等[9]。近年來，隨著高通量測序技術的快速發展，多個物種基因組測序已經完成，將有助于在全基因組水平上揭示密碼子使用偏好性。目前，已在多個模式生物和非模式生物中對單基因或基因組密碼子使用偏好性進行了深入的研究，如毛果楊(Populustrichocarpa)[10]水稻(Oryzasativa)[11]和蘋果(Malusdomestica)[12]等。而紅松(Pinuskoraiensis)基因組測序尚未完成，相關分子研究基礎較為薄弱，在紅松中還未見對單基因進行密碼子偏好性分析的報道。

紅松為松科(Pinaceae)松屬(PinusLinn.)常綠針葉樹，是我國東北地區珍貴的用材樹種和經濟林樹種，具有重要的經濟價值和生態價值[13～14]。其材質輕軟、耐腐蝕性強，樹皮富含松多酚，具有極高的開發價值。多酚是一種廣泛存在于植物的根、葉、皮等器官中的一種次生代謝化合物，具有多種生理功能，可降低血脂，減緩衰老，現已在材料、食品等多個領域被廣泛應用。松多酚是松科植物中特有的多酚類化合物，其含量豐富，具有抗炎鎮痛、降血壓等功效，科研工作者對松多酚開展了大量的研究[15]。研究發現，松多酚中含有類黃酮和花色素，使植物的花、果實等器官呈現不同的顏色[16]。關于松多酚的分子研究較為廣泛，松多酚合成過程中相關功能基因很多，主要包括查爾酮合成酶(CHS)、黃酮醇合成酶(FLS)和查爾酮異構酶(CHI)等。其中，查爾酮合成酶(CHS)是植物中黃酮、花色素和異黃酮等化合物合成的關鍵酶之一，在多酚合成過程中發揮著重要的作用，可影響植物的花色及防御反應[17]。查爾酮合成酶基因CHS于1983年首次在荷蘭芹(Petroselinumcrispum)[18]中發現，現已在多個植物中克隆得到了CHS基因，如甘薯(Pomoeabatatas)[19]、桂花(Osmanthusfragrans)[20]和樟子松(Pinussylvestris)[21]和擬南芥(Arabidopsisthaliana)[22]等。而關于CHS基因密碼子偏好性的研究較少，僅有部分植物研究中有報道。前人研究發現，不同植物中的CHS密碼子偏好性存在一定差異，如蓼科大黃屬物種[23]和獼猴桃中CHS基因[8]最優密碼子偏愛以G/C結尾，而豆科植物CHS基因[24]對A或U結尾的密碼子偏好性較強。目前，關于紅松CHS基因方面的報道較少[25～26]，相關功能還不清楚，開展CHS密碼子偏好性分析將有助于研究該基因的遺傳特征和分子機理，進而為有效利用松多酚資源奠定一定的基礎。筆者從GenBank中獲得紅松查爾酮合成酶基因CHS序列，采用EMBOSS在線程序、MEGA7.0軟件[27]和CodonW分析其密碼子偏好性，運用R語言軟件(version 3.5.0)[28]和SPSS(version 23.0)軟件[29]統計密碼子偏好性參數，為CHS基因功能和分子進化的深入研究提供理論依據。此外，將CHS的密碼子偏好性與大腸桿菌、酵母、煙草和擬南芥的基因組密碼子進行比較,以期為篩選該基因的理想表達系統奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 序列來源

本研究采用的紅松查爾酮合成酶基因CHS編碼區序列來自NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，Genbank登錄號為KJ796482.1。以Chalcone Synthase為關鍵詞從NCBI中檢索并下載蘋果(Malusdomestica)、北美喬松(Pinusstrobus)、大豆(Glycinemax)、獼猴桃(Actinidiachinensis)和玉米(Zeamays)等其他24種植物CHS基因的編碼序列用于本研究，登錄號見表1。

表1 不同植物CHS基因完整CDS編碼序列

Table 1 Complete CDS sequence coding frame ofCHSgene in different plants

序號Number物種Species編號ID登陸號Accession number1紅松Pinus koraiensisPkKJ796482.12甘藍Brassica oleraceaBoHQ189776.13北美喬松Pinus strobusPsAJ004800.14碧桃Prunus persicaPpHM543568.15草莓Fragaria×ananassaFaAB201758.16大豆Glycine maxGmXM_003553938.47杜鵑花Rhododendron simsiiRsAJ413277.18柑橘Citrus sinensisCsAB009350.19高粱Sorghum bicolorSbAF15255310菊花Chrysanthemum×morifoliumCmDQ521272.111大麥Hordeum vulgareHvAY28609312獼猴桃Actinidia chinensisAcKF157394.113擬南芥Arabidopsis thalianaAtNM_121396.414蘋果Malus domesticaMdAB074485.115葡萄Vitis viniferaVvNM_001281135.116水稻Oryza sativaOsAB000801.217王府海棠Malus hybridMhFJ599763.118西洋梨Pyrus communisPcDQ901397.219煙草Nicotiana tabacumNtNM_001326166.120玉米Zea maysZmNM_001148774.121赤松Pinus densiflora pdchsxPdAB01549022毛果楊Populus trichocarpaPtDQ37180423馬尾松Pinus massonianaPmKF30388324輻射松Pinus radiataPrKF70481725海岸松Pinus pinasterPp1AY168850

1.2 分析方法

1.2.1 密碼子偏好性參數分析

將25種植物的CDS序列整理后，利用分析平臺Galaxy(version 1.4.4)(https://galaxy.pasteur.fr/)中的CodonW模塊和EMBOSS在線軟件(http://www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/)的CUSP模塊與CHIPS模塊對CHS進行密碼子偏好性參數分析，包括同義密碼子相對使用度(RSCU)、密碼子適應指數(CAI)、有效密碼子數(ENC)、密碼子G和C總含量(GC)、密碼子末位堿基G或C的含量(GC3s)和密碼子使用頻率(frequency)等。從Condo Usage Database(http://www.kazusa.or.jp/codon/)數據庫中獲得模式生物擬南芥(Arabidopsisthaliana)、酵母(Saccharomycescerevisiae)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和煙草(Nicotianasylvestris)基因組的密碼子使用頻率數據。

RSCU是指某些特定密碼子在同義密碼子中的相對概率，一般地，RSCU值大于1，表示該密碼子使用偏好性強，而RSCU值小于1，表示無使用偏好性[10]。ENC值可反映所有密碼子中同義密碼子使用偏好程度，其分布范圍為20～61，該值是反應密碼子使用偏離隨機選擇的程度。ENC值越靠近20，該基因的密碼子偏好性越強，而越靠近61，偏好性越弱[30]。CAI值范圍為0～1，該值越接近1，表明該基因的偏好性越強，而越接近0，則偏好性越弱[31]。密碼子的第3位堿基中G+C的含量與第3位堿基總量的比值即GC3s。GC含量是指目的序列中鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)所占的比率。

1.2.2 聚類分析

基于密碼子使用偏好性的聚類分析是以不同物種的簡并密碼子(去除終止密碼子TAA、TAG和TGA，起始密碼子ATG和甲硫氨酸TGG)的RSCU值為變量，采用R語言中的pheatmap包(https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html)繪制系統聚類熱圖。基于CDS編碼區序列的聚類分析是采用MEGA7.0(Neighbour-Joining,NJ)構建的系統發育樹，并利用在線軟件繪圖工具iTOL(Interactive Tree Of Life，https://itol.embl.de/)對進化樹進行可視化展示。

2 結果分析

2.1 紅松CHS密碼子使用偏好性分析

對紅松CHS基因使用頻率和RSCU值統計發現(詳見表2)，61個密碼子中使用頻率最大的是AAG和GAG(45.34%)，26個密碼子RSCU值大于1，是紅松CHS基因的偏好密碼子。GCC、TTC、GGA、ATC、CCC、AGA、AGT、CTC、CTG、TAC共10個密碼子的RSCU值大于1.5，表明是該基因的高頻率密碼子，其中GGA(2.06)、CCC(2.48)、AGA(2.47)、CTG(2.31)這4個密碼子的RACU值均大于2，表明該基因對這些密碼子具有極強的偏好性。我們發現，編碼Leu的CTA的RSCU值為0，說明該密碼子可能不參與紅松CHS基因的翻譯過程。此外，紅松中NTA型密碼子(GTA:0.38,ATA:0.33,TTA:0.15,CTA:0)的RSCU值較低，這可能有利于mRNA的降解以提高蛋白含量，NCG型的密碼子RSCU值(CCG:0.19,GCG:0.48,TCG:1.43,ACG:0.50)較低，表明紅松可能是一種甲基化程度較高的植物。

表2 紅松CHS基因同義密碼子相對使用度

注：下劃線表示紅松CHS基因該密碼子使用頻率較高

Note：The underlines mean codon usage with high frequency inCHSofP.koraiensis

表3 物種間CHS密碼子偏好性分析

圖1 基于密碼子使用頻率的聚類分析 *表示RSCU值大于1的密碼子Fig.1 Cluster analysis heatmap of codon usage frequency * means the RSCU value is more than 1

圖2 25種植物CHS基因的聚類樹狀圖 ★代表被研究的物種Fig.2 Cluster dendrogram of CHS gene from 25 plant species ★ represents the species studied

根據密碼子偏好性參數分析結果(詳見表3)，發現紅松CHS基因編碼區的ENC值為48.92，遠離20，更接近61，表明該基因的密碼子使用偏好性較弱，蛋白質的表達量可能偏低；CAI值為0.762，表明其密碼子偏好性一般；紅松CHS基因編碼區的GC含量為0.548，略大于0.5，而GC3s值是0.351，小于0.5，表明紅松CHS基因在堿基利用時，更傾向于C+G，對以A/T結尾的密碼子偏好性較強。

2.2 物種間CHS密碼子使用偏好性比較

25種植物的GC3s、GC含量、CAI值、RSCU值和ENC值如表3所示。25個物種的ENC平均值為50.29，最小的是玉米(29.05)，表達水平較高，最大的是柑橘(58.89)，表達水平較低。進一步分析ENC值發現，多數植物CHS基因的ENC值均大于35.0，表明多數植物CHS基因的密碼子偏好性較弱，而禾本科植物CHS基因的ENC值均小于35(除高粱外)，表明禾本科植物CHS基因具有更強的密碼子偏好性。25個物種CHS基因的CAI值介于0.647～0.762，平均值為0.729，表明密碼子選擇偏好性一般。對GC含量研究發現，GC含量范圍為0.473～0.984，平均值為0.632，其中22個物種的GC含量均大于0.5，而GC3s值大于0.5的物種也有22個，表明不同物種CHS密碼子選擇偏好性存在差異，多數物種的G+C含量高于A+T含量，且密碼子更偏好C/G結尾。通過RSCU值對25個物種CHS密碼子使用偏好性分析，結果表明，菊花RSCU>1的密碼子數目最多為31個，高粱、擬南芥、赤松、輻射松最少為23個；水稻RSCU>1.5的密碼子最多達23個，海岸松最少有7個。同時，禾本科植物RSCU>1.5的密碼子數目要比其他植物多，表明禾本科植物密碼子使用偏好性比其他植物強，與基于ENC的分析結果相同。除毛果楊外，其他24種植物共同偏好使用的密碼子是CTC，該密碼子在禾本科植物CHS基因中使用偏好性明顯較其他植物強(見圖1)。

2.3 CHS基因密碼子使用偏好性和CDS序列的系統聚類分析

對25種植物的CHS基因密碼子使用偏好性進行聚類分析(見圖1)。結果表明，25個物種CHS分為2大類，樣本數分別為4和21，其中禾本科植物聚成一大類(水稻、高粱、玉米、大麥)，剩余的植物聚為一大類，說明它們之間的密碼子偏好性存在明顯的差異，其他分支又分為許多小的聚類中心。其中同屬于松科的馬尾松、赤松和紅松的CHS基因聚在一個小支上，輻射松、海岸松和北美喬松聚在另一個小支上，這兩個小支共聚在一個大支上面，表明具有相近親緣關系的物種在密碼子使用模式上較為相似。進一步分析發現，同屬薔薇科的王府海棠、西洋梨和蘋果也聚在一個小支上，碧桃和草莓聚在一個小支上，這兩個小支共聚在一個大支上面，說明基于RSCU值的聚類結果與傳統分類學很相近。而毛果楊、擬南芥和獼猴桃各單獨成為一個小分類，說明毛果楊、擬南芥和獼猴桃的CHS基因在密碼子使用上與其他植物存在差異。同時，擬南芥和紅松聚在一個大支上，一定程度上說明擬南芥作為受體植物研究紅松CHS基因更具有優勢。此外，不是同一科的煙草、菊花和柑橘聚在一個小支上，說明它們的CHS基因在密碼子使用偏好性上較為相似。因此，RSCU值是研究植物進化關系一個很好的參數。對25種植物的CHS基因密碼子使用頻率統計發現，61個密碼子可分為4大類，其中CTC密碼子在所有物種中均出現，其在單子葉植物中的使用頻率明顯高于雙子葉植物。值得注意的是，AGA、GGA、GGT和TCT等密碼子僅在部分雙子葉植物中使用頻率較高，而在單子葉中使用頻率較低，甚至不會出現。運用MEGA7.0將不同物種的CDS序列進行聚類分析，進一步分析紅松CHS基因與其他物種間的親緣關系，結果發現(見圖2)禾本科4種植物的CDS序列同源性較高，聚在一個大的分支上，這一聚類結果與基于RSCU值的聚類分析結果相似，但此時水稻和大麥沒有聚在一個小分支上。另外，從圖中可看出紅松、赤松、海岸松、北美喬松、馬尾松和輻射松等6種松科植物均聚在一個大支上，這一結果與基于RSCU值的聚類結果一致，其中紅松CHS基因的CDS序列與北美喬松和海岸松的同源性較高。基于RSCU值聚類結果在一定程度上可反映紅松的進化規律，但基于CDS序列的聚類結果與普通分類學結果更接近。

2.4 紅松CHS受體系統選擇

密碼子使用頻率的比值大小是評價不同物種間密碼子使用偏好性的重要參數，當該值≤0.5或≥2時，表示兩個物種間密碼子使用偏好性差異較大，反之密碼子使用較為一致。將紅松CHS密碼子使用頻率與煙草、大腸桿菌、擬南芥和酵母進行比較分析(見表4)。由表4可知，紅松CHS與煙草、大腸桿菌、擬南芥和酵母基因組中使用偏好性差異較大的密碼子分別有31、31、28和34個，大腸桿菌、酵母菌密的碼子使用頻率差異較小，其中大腸桿菌表達系統更適用于紅松CHS的異源表達，擬南芥可能為CHS基因遺傳轉化試驗最佳的受體材料。

表4 紅松CHS基因與部分模式植物基因組密碼子使用偏好性比較

Table 4 Comparison of codon usage preference betweenCHSgene inP.koraiensisand the other representative organisms

密碼子Condon氨基酸Amino acidPkScEcNsAtPk/ScPk/EcPk/NsPk/AtGCAA17.616.22322.917.51.090.7670.771.01GCCA32.712.621.612.910.32.601.5162.543.18GCGA10.16.221.14.791.630.4782.141.12GCTA22.721.218.934.528.31.071.1990.660.80TGCC15.14.85.57.57.23.152.7482.022.10TGTC5.08.15.98.710.50.620.8540.580.48GACD35.320.217.916.217.21.751.9702.182.05GATD22.737.633.735.636.60.600.6730.640.62GAAE15.145.635.135.834.30.330.4310.420.44GAGE45.319.219.427.932.22.362.3371.631.41TTCF32.718.413.917.420.71.782.3561.881.58TTTF5.026.124.423.621.80.190.2060.210.23GGAG42.810.913.626.224.23.933.1491.631.77GGCG25.29.820.614.39.22.571.2231.762.74GGGG5.06.012.311.210.20.840.4100.450.49GGTG10.123.923.731.622.20.420.4250.320.45CACH12.67.87.38.78.71.611.7251.451.45CATH5.013.612.410.813.80.370.4060.470.37ATAI5.017.813.310.612.60.280.3790.480.40ATCI30.217.219.413.918.51.761.5582.171.63ATTI10.130.129.626.121.50.330.3400.390.47AAAK17.641.937.228.430.80.420.4740.620.57AAGK45.330.815.332.432.71.472.9631.401.39CTAL0.013.45.67.19.90.000.0000.000.00CTCL30.25.49.511.916.15.603.1822.541.88CTGL37.810.537.47.49.83.601.0105.113.86CTTL15.112.314.525.424.11.231.0420.600.63TTAL2.526.217.412.012.70.100.1450.210.20TTGL12.627.212.923.320.90.460.9760.540.60ATGM32.720.923.724.224.51.571.3821.351.34AACN15.124.820.316.920.90.610.7440.890.72AATN12.635.729.322.722.30.350.4300.550.56CCAP7.618.39.123.516.10.410.8300.320.47CCCP32.76.86.26.95.34.825.2824.756.18CCGP2.55.314.54.88.60.480.1740.520.29CCTP10.113.59.520.818.70.751.0610.480.54CAAQ12.627.314.421.519.40.460.8750.590.65CAGQ35.312.126.716.415.22.911.3212.152.32AGAR17.621.37.116.719.00.832.4831.060.93AGGR10.19.24.013.811.01.102.5190.730.92CGAR0.03.04.84.26.30.000.0000.000.00CGCR5.02.614.04.93.81.940.3601.031.33CGGR7.61.77.94.74.94.450.9571.611.54CGTR2.56.415.910.79.00.390.1580.240.28AGCS12.69.814.39.811.31.290.8811.291.11AGTS15.114.213.212.114.01.061.1451.251.08TCAS0.018.713.114.618.30.000.0000.000.00TCCS10.114.29.711.011.20.711.0390.920.90TCGS12.68.68.23.39.31.461.5363.821.35TCTS2.523.513.121.925.20.110.1920.120.10ACAT15.117.815.115.515.70.851.0010.980.96ACCT17.612.718.910.610.31.390.9331.661.71ACGT7.68.013.63.77.70.940.5562.040.98ACTT20.220.313.121.017.50.991.5380.961.15GTAV7.611.813.111.19.90.640.5770.680.76GTCV30.211.813.111.112.82.562.3072.722.36GTGV22.710.819.917.417.42.101.1391.301.30GTTV20.222.121.628.427.20.910.9330.710.74TGGW10.110.413.412.612.50.970.7520.800.81TACY17.614.811.714.913.71.191.5071.181.29TATY5.018.821.616.914.60.270.2330.300.35TAA*2.51.12.00.70.92.291.2603.602.80TAG*0.00.50.30.50.50.000.0000.000.00TGA*0.00.71.11.21.20.000.0000.000.00

3 討論

同義密碼子由于存在簡并性，往往不會影響氨基酸的編碼，進而不會改變蛋白質的結構功能，因此，不會對細胞功能產生嚴重的影響。但是，經過長期的進化，有些密碼子在基因或測序基因組中比其他密碼子出現得更頻繁，密碼子偏好性是廣泛存在且在部分物種中是非常強烈的，將特定的密碼子進行的同義突變處理，可使目的基因的表達量顯著提高[32]，在提高外源基因轉化效率方面具有重要的作用。

密碼子使用偏好性是物種在漫長的自然選擇和進化進程中形成的適應性選擇，對研究基因的進化和功能鑒定具有重要的意義。然而，紅松中相關研究還未見報道。本研究通過對紅松CHS基因密碼子使用模式進行分析，確定了GCC、TTC、GGA、ATC、CCC、AGA、AGT、CTC、CTG、TAC共10個密碼子是該基因的高頻率密碼子，其中GGA、CCC、AGA、CTG這4個密碼子具有極強的偏好性，可作為該基因的最優密碼子，同時也存在CTA、CGA和TCA等不參與該基因編碼過程的密碼子，說明紅松CHS進化過程可能較為復雜。紅松CHS與赤松、馬尾松、海岸松、北美喬松和輻射松的ENC值均大于48，可見松科植物的密碼子使用偏好性相對較弱，對密碼子的選擇具有較高的隨機性。先前的研究發現，單子葉植物基因偏向于C/G結尾的密碼子，雙子葉植物基因偏向于A/T結尾的密碼子[33]，而在裸子植物中還沒有相關的結論。本研究表明，在基因密碼子堿基選擇時，紅松CHS基因編碼區GC3s含量小于0.5，更偏好于A/T結尾的密碼子，這可能是由于紅松在進化過程中主要以GC到AT突變方向為主有關，而松科的其他幾個物種的GC3s含量均大于0.5，AT到GC的突變壓力要比GC到AT的突變壓力大，說明紅松存在特殊的密碼子使用模式和進化形式。此外，4個NTA和NCG型密碼子的RSCU值較低，說明紅松的甲基化程度可能較高。

研究表明，基因的密碼子使用特性在不同物種之間可能存在明顯差異，但在親緣關系較近的物種之間差異較小，反之差異較大[34]。基于密碼子使用偏好性和基于CDS序列的聚類分析結果存在著一定的差異，這與前人的研究結果一致[35]。而將兩種方法相結合可在一定程度上客觀反應出物種的進化規律，其中基于CDS序列的聚類分析更能反映出系統分類學中物種間的親緣關系。本研究表明紅松與赤松、海岸松、北美喬松、馬尾松和輻射松等6種松科植物在兩種聚類方式中均聚在一個大支上，同屬薔薇科的王府海棠、西洋梨、蘋果、碧桃和草莓也聚在一個大支上，進一步說明親緣關系較近的物種一般具有相似的密碼子使用偏好性，這與在大豆(Glycinemax)[24]、籽粒莧(Amaranthushypochondriacus)[36]、小麥(Triticumaestivum)[37]等植物中的研究結果一致。研究中發現禾本科4種植物的CDS序列同源性較高，這一聚類結果與基于RSCU值的聚類分析結果相似，但在更小的分類單元上，水稻和大麥沒有聚在一個小分支上，這可能是由于在物種進化過程中由于發生突變而造成CHS基因密碼子使用偏好性存在差異。

在基因工程研究中，外源目的基因在受體細胞中的表達效率常與外源基因的結構密切相關，其中外源目的基因與模式物種基因組密碼子使用偏好性是一個重要的指標，尤其是稀有密碼子，可在一定程度上影響外源基因的轉化、轉錄表達水平及相應功能[38]。本研究表明，擬南芥和大腸桿菌可能作為紅松CHS遺傳轉化和異源表達較為理想的受體，這與陳義挺等[10]對獼猴桃的研究結論一致。通過遺傳轉化技術改良林木品質是一種強有力的方法，可對CHS基因的部分密碼子進行特殊優化和定向改造，以期獲得穩定高效表達的遺傳轉化體系。隨著測序技術的不斷發展，越來越多的林木完成了全基因測序，為林木基因工程的開展和遺傳改良奠定了基礎。今后，根據林木CHS基因或基因家族的密碼子使用偏好性特征，在全基因組水平上進行相應的遺傳改造，不僅能有效促進類黃酮類物質的合成，還對林木花色、抗逆性、轉基因育種、基因家族起源及基因復制的研究具有巨大的理論意義。