發酵液中甘油和丁醇含量的近紅外快速檢測方法

趙 昇，王曉榮，張進明

〈紅外應用〉

發酵液中甘油和丁醇含量的近紅外快速檢測方法

趙 昇，王曉榮，張進明

（南京工業大學 電氣工程與控制科學學院，江蘇 南京 211800）

為了提高生物發酵過程的控制與優化水平，試對發酵底物甘油和目標產物丁醇的含量進行快速無損檢測進行研究。首先對80份甘油與丁醇的單體系樣本進行近紅外掃描并進行光譜分析。為提高模型的預測能力，分別采用了偏最小二乘法、間隔偏最小二乘法、向前間隔偏最小二乘法、向后間隔偏最小二乘法和窗口移動最小二乘法5種定量校正方法建立甘油和丁醇含量的近紅外檢測模型并對模型進行分析與比較。結果表明，向后間隔偏最小二乘法建立的模型效果較好，甘油和丁醇的單組份溶液的檢測模型相關系數分別達到0.99932（甘油）和0.98843（丁醇）。為測量真實的甘油發酵液中甘油和丁醇含量，搭建并建立了甘油和丁醇濃度監測平臺，驗證得相關系數分別達到0.99074（甘油）和0.99261（丁醇）。結果表明建立的近紅外快速檢測模型在檢測的準確性和快速性上均有優異的性能，為發酵行業快速檢測提供了新的檢測手段。

近紅外光譜技術；向后間隔偏最小二乘；甘油發酵；丁醇

0 引言

生物發酵行業是我國的支柱行業之一，但由于生產技術比較落后，發酵產物中附加產物較多，而且新一代的發酵制品如生物酶、干擾素等前沿產物主要被歐美國家控制，我國發酵工業的技術水平與國外仍有較大差距。由于發酵過程比較復雜，傳統的生物傳感器在自動控制系統中不能滿足生產需求，生產過程最直接的控制參數生物（生化）參數（包括底物、重要中間代謝物和目標產物等）快速檢測或在線檢測技術的缺乏，是整個行業面臨的瓶頸技術?？梢?，快速監測發酵液底物與產物的變化對于實現工業發酵從“粗放化、間歇式”向“精密化、連續化”的生產方式的轉型具有重要的現實意義[1]。而丁醇作為一種有機化工原料，其熱值與辛烷值和乙醇十分相似，且具有能量含量高、揮發性低、減少溫室氣體排放等優點被認為是比乙醇更為理想的燃料，丁醇還可以用于塑料制品的制造及食用香味的提取等。但工業生產丁醇主要以石油為原料，而隨著能源的枯竭，發酵法的發展前景越來越受重視，大有取代化學法的趨勢。因此，十分有必要研究并提供一種快速檢測發酵液中甘油與丁醇含量的方法[2]。

近紅外光譜技術在檢測含氫、碳、氮等有機物的成分上其優勢非常明顯，因其速度快、無損性、易操作等檢測的優點，被廣泛應用[3]。國內外很多專家學者應用近紅外技術在發酵檢測領域進行學術研究。Cavinato等采用短波近紅外光譜技術對發酵過程中乙醇的含量進行了測定[4]。Macalony等人在工業上高密度大腸桿菌發酵過程中采用了近紅外光譜測定了甘油、銨鹽和乙酸的濃度[5]。Arnold等人采用近紅外光譜技術測定CHO細胞分批發酵過程中氨酰胺、氨基酸、葡萄糖與乳酸的含量[6]。但甘油和丁醇這些中工業發酵過程起關鍵作用而光譜相似的狀態變量卻是鮮有報道。而且基于MEMS的近紅外光譜儀體積小、分辨率高、價格低，解決了目前由于光譜儀體積大，價格高等原因造成其在發酵工業中不能普及的問題[7]。因此，本文開展了基于MEMS近紅外分析技術在甘油轉丁醇的發酵過程對參數進行快速檢測的應用與研究，為甘油發酵過程中檢測甘油與丁醇含量提供了一種快速、低價格的檢測手段。

1 檢測模型的比較

1.1 試劑與儀器

DLP NIRscan Nano EVM近紅外光譜儀，電子天平（精度為0.0001g）、恒溫箱、去離子蒸餾水、量筒、培養皿、滴管、甘油、丁醇等。

1.2 儀器參數設定與光譜采集

配置不同濃度的甘油與丁醇溶液，采用去離子蒸餾水精確配置容量為4mL，濃度為1～80g/L的甘油與丁醇的樣本溶液80份，濃度間隔為1%。采用美國TI公司生產的NIRscan Nano近紅外光譜儀，掃描32次，分辨率為7cm－1，波數間隔為2cm－1。以空氣為參比，室內溫度保持在25℃左右，濕度基本保持不變，每個樣本平行采集3次，取其平均光譜作為該樣本的原始光譜。

1.3 樣本集的劃分

若選擇的校正樣本比較具有代表性，則在建模的時候可以減少很多的工作量，而且可以提高模型的精確度[8-9]。濃度梯度法可以有效地涵蓋組分含量，避免了樣本集劃分的不均勻，而且保證了后續處理和建模方法的適用范圍。根據濃度梯度法本文將正常的74個甘油與丁醇樣本按照濃度梯度法2:1的比例進行排序。表1為劃分校正集與預測集的有機質含量統計表，校正集中甘油含量的范圍為：1～80g/L，預測集中甘油含量為：4～79g/L；丁醇校正集含量范圍為：1～80g/L，預測集含量為：3～79g/L。

1.4 光譜預處理

在實驗過程中儀器的噪音總會避免不了，因此在模型建立之前要先對光譜進行預處理[10]。本文采用S-G、多元散射校正、導數校正和標準正態校正對甘油和丁醇樣本的光譜進行預處理，結果如表2所示。

從表2中我們可以看出，不同的預處理方法，對建立的模型精度有不同的影響。模型評價指標有很多，本文選用了相關系數（c）和交互驗證均方根誤差（Root Mean Square Error For Validation，RMSECV）作為評價模型的可信度。一般來說，相關系數越大，交互驗證均方根誤差越小，說明近紅外模型的測定值與實際值越吻合，模型的準確度越高，也即所建立的模型效果越好。明顯可以看出采用標準正態變量（Standard Normal Variables，SNV）的方法在c和（Root Mean Square Error For Prediction，RMSECP）兩個指標上性能優異，是最優的預處理方法。

1.5 模型的建立與最優模型的建立

本實驗分別在甘油和丁醇的原始光譜圖采用SNV預處理之后，建立了偏最小二乘法（Partial Least Squares，PLS）、間隔偏最小二乘（Interval Partial Least Squares，IPLS）、向前間隔偏最小二乘法（Forward Interval Partial Least Squares，FIPLS）、向后間隔偏最小二乘法（backward Interval Partial Least Squares，BIPLS）、移動窗口偏最小二乘法（Moving Window Partial Least Squares，MWPLS）5種校正集樣本模型[11-13]。建模結果采用RMSECV作為模型的最終評價指標，表3為PLS模型預測結果。

表1 校正集與預測集生物量的測量結果

表2 不同預處理結果甘油和丁醇的預測模型結果

表3 PLS模型的預測結果

從甘油與丁醇的預測結果來看，5種PLS回歸模型中，iPLS、FiPLS、BiPLS、MWPLS都是對偏最小二乘法的改進，模型的穩定性與準確度有一定的提高。通過數據比較，可以得出BiPLS模型可以減少無效波段對模型的影響，同時減少了計算機的計算量，建立的模型效果最好。但真實的發酵過程，發酵液的組成成分與標準溶液有很大的區別，且丁醇的含量是逐漸上升的，模型的效果還需經過真實發酵液檢測進行驗證。

2 模型的驗證

2.1 發酵液的制備與測定

儀器：生物傳感儀、DLP NIRscan近紅外光譜儀（美國德州儀器）、電子天平（精度0.0001g）、5L發酵罐、TQ Analyst計量學分析系統。

試劑：甘油、酵母粉、二硫蘇糖醇、L-半胱氨酸鹽酸鹽、九水硫化鈉、氯化鈉、六水氯化鎂、氯化銨等。菌體培養基參數如表4所示。

在實驗過程中，要保持發酵罐中的pH值為7.0～7.2；溶氧控制維持：0～10%；溫度控制：初始溫度為34℃。

表4 培養基參數列表

含量測定：實時取出的發酵液中甘油和丁醇的含量采用生物傳感儀進行測量，測量的數據用來建立甘油發酵液模型。然后再從發酵罐中取出10組未知濃度樣品檢測模型的準確性如表5所示（1已知樣本，2未知樣本）。

表5 發酵液中甘油與丁醇含量

2.2 近紅外光譜采集

采用近紅外漫反射法對上述發酵液進行采集，以空氣為參比。儀器參數設置為：分辨率為10nm，掃描次數30次。采集的光譜圖如圖1所示。

圖1 甘油發酵液的近紅外光譜圖

2.3 樣本集的劃分

按照濃度梯度法對樣本集按照校正集︰預測集＝2︰1的比例進行劃分。樣本劃分如表6所示。

2.4 模型的建立

本節直接將樣本光譜經過SNV預處理之后，再結合BiPLS建立模型，其結果如圖2和圖3所示。

由圖2和圖3可以看出，甘油發酵液的甘油校正模型相關系數為0.99074，交互驗證均方根誤差為1.11，而甘油發酵液的丁醇模型相關系數為0.99261，交互驗證均方根誤差為1.09，相關系數均接近1，RMSEC數值均較小，表明模型的預測能力較好，精確度較高。

2.5 傳統的生物測量法與近紅外檢測法的比較

使用生物傳感儀對未知樣本進行濃度測定，然后采用近紅外光譜儀對未知樣本進行光譜采集，使用建立的甘油發酵模型預測甘油與丁醇的濃度如表7，結果比較如圖4所示。

生物發酵中，基本上采用生物傳感儀測量發酵液的組分含量，目前市場上高精度的生物傳感儀的測量誤差基本也保持在1%～2%以內。從表7可以看出，當以生物傳感儀測量值為標準值時，采用近紅外光譜技術測量值甘油的平均測量誤差為3.29%，丁醇的平均測量誤差為4.58%。發酵過程需要控制測定范圍，測量誤差為5%，顯然精度是滿足要求的。從圖4可以看出模型對未知樣本的預測與傳統方法測定的真實值時極為接近的，模型的預測能力較好。近紅外光譜方法相比傳統的生物方法有著明顯的優勢，尤其在測量速度上，通常可以在幾秒內就可以完成，可應用于過程分析，而且不需對發酵液進行預處理，降低了人為因素誤差。因此，近紅外光譜分析技術測定甘油發酵過程中甘油與丁醇的含量是一種切實可行的快速檢測方法。

表6 樣本集的劃分

圖2 甘油發酵液中甘油校正模型預測圖

圖3 甘油發酵液中丁醇校正模型預測圖

表7 傳統生物檢測與近紅外檢測結果

圖4 傳統生物測量方法與近紅外檢測結果示意圖

3 總結

本文研究了近紅外光譜技術在發酵制備丁醇過程中底物甘油和丁醇含量的快速檢測方法。首先根據甘油與丁醇的近紅外微觀特性，確定了甘油和丁醇的吸收峰分別為（1149～1265nm和1666～1801nm），然后采用PLS、iPLS、FiPLS、BiPLS、MWPLS對甘油與丁醇的單體系溶液，建立了校正模型。通過對比分析，BiPLS可以減少無效波段對模型的影響，同時減少了計算機的運算量，建立的模型效果最好，為真實甘油發酵的模型建立提供了數據基礎。針對甘油發酵液的特性，采用了BiPLS建立了甘油發酵液的校正模型，并采用傳統生物檢測方法和甘油發酵模型對未知樣本進行預測。實驗表明，在甘油轉丁醇的發酵過程，NIRS可以作為一種快速、低價格的檢測手段，為發酵行業實現自動化控制提供了理論基礎與數據支持。

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Rapid Detection of Glycerol and Butanol in Fermentation Broth Using Near-Infrared Spectroscopy

ZHAO Sheng，WANG Xiaorong，ZHANG Jinming

(College of Electrical Engineering and Control Science, Nanjing Tech University, Nanjing 211800, China)

In this paper, to improve the control and optimization of the bio-fermentation process, rapid and non-destructive detection of glycerol and butanol was studied. To this end, 80 samples of glycerol and butanol were scanned and analyzed by means of near-infrared spectroscopy. Furthermore, in order to improve the predictive ability of the model, five quantitative calibration methods, namely, the partial least squares method, interval partial least squares method, forward interval partial least squares method, backward interval partial least squares method, and minimum forward interval method were used to establish the near-infrared detection model for glycerol and butanol content. The models were then analyzed and compared. The results showed that the model established by means of the backward interval partial least squares method was effective, and the correlation coefficients of the single component solution of glycerol and butanol were 0.99932 (glycerol) and 0.98843 (butanol), respectively. To measure the content of glycerol and butanol in the glycerol fermentation broth, a monitoring platform for glycerol and butanol concentrations was established. The correlation coefficients were found to be 0.99074 (glycerol) and 0.99261 (butanol), respectively. The results show that the NIR rapid detection model demonstrates excellent performance with regards to accuracy and rapidity and provides a new detection method for the rapid detection of glycerol and butanol in the fermentation industry.

near-infrared spectroscopy，backward interval partial least squares，glycerol fermentation，butanol

O657.33

A

1001-8891(2020)05-0488-06

2018-10-16；

2020-03-30.

趙昇（1995-），男，江蘇常州人，碩士研究生，主要從事嵌入式系統開發研究。E-mail：techmanx@163.com。

王曉榮（1972-），男，副教授，碩士生導師，主要研究方向為分析儀器和嵌入式系統設計。E-mail：wang@njut.edu.cn。