循環腫瘤細胞分離富集與分析檢測技術的研究進展

蒲思思 周朝輝 賈能勤

摘 要： 癌癥死亡患者中有90%由癌癥轉移引起，研究表明：患者的外周血、胸腔液等體液中的循環腫瘤細胞（CTC）與癌癥轉移及腫瘤結節轉移（TNM）分期密切相關.因此，CTC檢測在實體腫瘤前期診斷、預后及療效評估等方面扮演著舉足輕重的角色.該綜述基于CTC區別于正常細胞的物理學、電學、生物學特征，總結了目前CTC分離富集及分析檢測技術的研究進展，并就國內外CTC檢測面臨的挑戰進行了討論，對其未來發展趨勢進行了展望.

關鍵詞： 循環腫瘤細胞（CTC）; CTC檢測; 分離富集

中圖分類號： O 6-1; R 730.4? 文獻標志碼： A? 文章編號： 1000-5137（2020）02-0219-15

Research progress on isolation，enrichment and detection of circulating tumor cells

PU Sisi， ZHOU Chaohui， JIA Nengqin^*

（College of Chemistry and Materials Science，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Abstract： Lots of studies showed that cancer metastasis is the main cause of 90% cancer mortality，and the number of circulating tumor cells （CTC） in body fluids such as peripheral blood and pleural fluid and so forth is closely related to the cancer metastasis and tumor node metastasis （TNM） staging.Therefore，CTC detection plays a pivotal role in preclinical diagnosis，prognosis，efficacy evaluation，and so on.This review summarizes the separation，enrichment and identification techniques for CTC detection based on the physical，dielectric and biological properties of CTC that are different from normal cells，and discusses the current progress and clinical application of CTC detection at home and abroad.In addition，the challenges and future prospect of CTC detection are discussed.

Key words： circulating tumor cells（CTC）; CTC detection; isolation and enrichment

0 引 言

在1869年，ASHWORTH^[1]首次報道了血液中存在與其患者腫瘤具有相同大小、形狀和外觀的上皮腫瘤細胞，即循環腫瘤細胞（CTC）.在實體腫瘤部位，腫瘤細胞發生上皮至間充質的轉換 （EMT），E-鈣黏連蛋白表達降低，腫瘤細胞脫離，隨后內滲進入血管.多數CTC發生凋亡或被吞噬，只有不足0.01%的CTC可逃過人體自身免疫的捕殺，而腫瘤微栓子（CTM）的集體遷移及更高的存活率，使其更具有轉移和侵襲的潛力^[2].CTC隨著循環系統到達遠端器官，再外滲出血管，找到合適的“土壤”，并發生黏附，進行間充質至上皮的轉換（MET），開始血管的生成及腫瘤細胞的增殖與生長，繼而發展成實體腫瘤，形成致死性轉移^[3].擴散的腫瘤細胞甚至可以循環到骨髓中，并休眠于此，數年后，重新進入血液形成繼發性轉移^[4].

目前，腫瘤診斷嚴重依賴于影像學檢測和組織切片，腫瘤細胞的脫落、侵襲并進入血液循環是實現腫瘤轉移的最初階段，為最終形成腫瘤轉移病灶提供了可能.由此可見，CTC檢測對于癌癥的早期診斷，以及檢測患者的術后復發與轉移、評估療效與預后、選擇合適的個體化治療等方面具有重要的臨床意義，且能幫助理解CTC在外周血中的存活、吸附、侵襲等生物學行為，破譯腫瘤轉移的機制.通過綜述CTC富集技術及分析檢測技術，深入探討了CTC檢測的研究進展及其面臨的挑戰，并對未來發展趨勢做出展望.

1 CTC分離富集技術

1.1 物理特性富集法

1.1.1 基于尺寸差異分離富集

“不死”腫瘤細胞的異常增殖，使其區別于正常細胞，具有較大的核質比及細胞尺寸，且不同腫瘤細胞系的細胞平均直徑與白細胞直徑的比率不同^[5].而白細胞和紅細胞等正常血液細胞的尺寸較腫瘤細胞小，紅細胞直徑約為4～8 μm，白細胞尺寸約為6～19 μm.該差異為基于細胞尺寸差異的無生物標記的分離富集提供可能.

基于尺寸的分離富集常采用8 μm孔徑的臨界尺寸（D），有效截留CTC，過濾除去尺寸較小的紅細胞、白細胞.2011年，TIBBE等^[6]在上皮腫瘤細胞過濾技術 （ISET）平臺，采用氫氧化鈉刻蝕法制備具有8 μm孔徑的聚碳酸酯膜分選CTC，在4 h內成功分離肺癌患者外周血中的CTC和CTM.為避免ISET技術中孔不均勻密度分布的缺點^[7]，具有體積小、易加工、無毒及易自動化優勢的微小型裝置被廣泛研究，如新月形隔離微結構的微裝置^[8]、柔性微彈簧陣列裝置^[9]、蛇紋通道的微裝置^[10]等，實現了對CTC的高通量、高靈敏檢測.ZHENG等^[11]采用濕法刻蝕設計了圓形孔（D=11 μm）的聚對二甲苯膜微過濾器裝置，用于捕獲和電解人血液CTC，同時利用聚合酶鏈反應（PCR）進行基因組分析.除膜過濾，基于細胞尺寸差異捕獲的微流控芯片分離富集技術也廣受關注^[12-14].如圖1所示，KIM等^[15]通過離心處理血樣后，利用CAV1-EpCAM偶聯的微球，增大CTC與白細胞的尺寸差異，結合具有狹縫陣列的微流控芯片，自動化分離富集CTC.

基于細胞尺寸差異進行過濾富集CTC的技術避開了依賴于腫瘤細胞表面特異性抗原EpCAM的分離富集技術的局限，但在臨床應用中也有缺陷.COUMANS等^[16]研究發現，從轉移性乳腺癌患者、直腸癌患者、前列腺癌患者的全血中捕獲的CTC平均直徑為13.1，11.0，10.7 μm，比相應腫瘤細胞系的細胞直徑小.PARK等^[17]研究發現，相比于實驗室培養的前列腺癌（prostate）細胞（13.38±2.54 μm），從前列腺癌患者外周血中分離出來的CTC具有更小的尺寸（7.97±1.81 μm），并且形狀更細長，核質比也更高.因此，腫瘤細胞尺寸及其形變能力的異質性，使得基于細胞尺寸差異的分選方法具有較低的特異性及靈敏性，且過濾高濃度的顆粒物容易導致堵塞.

1.1.2 密度梯度分離（DGC）

對于復雜的人類外周血，在每毫升約10⁷～10⁹個血液細胞中，除了極少量的CTC以外，還有大量的紅細胞、中性粒細胞和單核細胞，其密度各有不同.紅細胞密度為1.10～1.15 g·mL^-1，白細胞密度為1.07～1.09 g·mL^-1，而腫瘤細胞的密度相對白細胞較低.基于Stokes-Einstein公式，采用一定密度的等滲溶液，如Ficoll或Percoll細胞分離液，進行密度梯度離心，將目標細胞分離開來.

作為標準化的血液細胞分離方法，密度梯度離心雖操作簡單、成本低廉，但回收率低，且CTC純度低.GERTLER等^[18]將新型密度梯度離心系統OncoQuick^TM與標準密度梯度離心系統Ficoll進行比較，發現改良的OncoQuick^TM密度梯度離心系統，結合基于CTC尺寸差異分離方法，于離心管中放入多孔的過濾膜，從10 mL血液中分離出9.5×10⁴個單核細胞，只需轉移到1～2個載玻片上進行免疫細胞化學評估，極大地減少了工作量，且提高了CTC檢出率.2004年，LARA等^[19]研究者結合密度梯度離心、陰性磁分選及過濾法富集CTC.先密度梯度離心除去大量的紅細胞，再用免疫磁分選除去大量的白細胞，最后通過過濾法過濾得到目標細胞CTC，如圖2所示.該方法有效避免了腫瘤細胞的密度異質性，將白細胞與腫瘤細胞成功地區分開來.

1.1.3 介電泳場流分級分離（depFFF）

腫瘤細胞的特殊組成、形態及表型使其介電特性異于紅細胞、T淋巴細胞等血液細胞的介電性質.當腫瘤細胞與血液細胞暴露在交變電場中，會發生不同的極化現象，從而具有不同的電動效應，導致細胞出現區域分布，此時若再施加適當的外部力，通常通過流體流動，洗除陰性細胞，便可截留下目標細胞，這樣的方法即是基于CTC介電異質性分離富集CTC的介電泳場流分級分離.

1995年，BECKER等^[20]采用17.6 mm×55.0 mm電極陣列的depFFF腔室，如圖3所示，利用介電親和力成功分離MDA-231乳腺癌細胞，實現了95%以上的回收率.通過斷開電壓釋放被電泳力（DEP）截留的CTC，釋放的CTC細胞活性大于98%，并且對CTC的生長能力幾乎沒有影響.1997年，GASCOYNE等^[21]細化并擴展了通過介電親和力進行細胞分選的原理，并得出了可以評估最佳細胞分選條件和效率的表達式.2009年，GASCOYNE等^[22]設計了帶有3 000個相互交錯的銅金電極元件的depFFF腔室（0.6 mm×25 mm×300 mm），實現了模擬小樣本的90%以上的腫瘤細胞回收率，并且能在15 min內完成細胞分離.

基于腫瘤細胞介電特性，可以實現對腫瘤細胞不同亞型的分離，且不需要對細胞進行任何的修飾或處理，對CTC下游分析來說，這是關鍵且重要的.depFFF相比于磁分選，其分選效率、回收率都較高.通過該方法分離富集的未經標記的活腫瘤細胞可用于培養，并進行所有分子類型的分析檢測.depFFF也可作為常規方法的輔助手段，以提高診斷和細胞分離應用的總體分辨率、速度和效率.

1.2 親和性富集法

1.2.1 磁分選富集技術

區別于正常細胞，腫瘤細胞表面會上調或下調相關抗原、蛋白質表達量，如上皮腫瘤細胞表面的上皮細胞黏附分子（EpCAM）、乳腺癌細胞表面人類表皮生長因子受體2（HER2）、非小細胞肺癌細胞表面表皮生長因子受體（EGFR）等，而正常細胞表面低表達，甚至不表達.再如白細胞表面特異性表達白細胞共同抗原（如CD45抗原），則在腫瘤細胞中不表達.磁分選富集技術，即基于這樣的生物學特征，在具有超順磁性的顆粒表面偶聯特異性抗體，如抗-上皮細胞黏附分子（EpCAM抗體/anti-EpCAM）、靶向腫瘤細胞，在外加磁場的作用下，腫瘤細胞被吸引而滯留在磁場中，從而分離出目標細胞（陽性分選），或是通過抗白細胞共同抗原的CD45抗體移除血液中的白細胞、巨核細胞及血小板（陰性分選）.基于免疫學方法對CTC進行富集，具有極高的特異性.

唯一被美國食品藥品管理局（FDA）批準的CellSearch^TM（Veridex）半自動檢測系統，通過免疫鐵磁流體靶向CTC表面的EpCAM抗原，從全血中分選CTC，然后對CTC進行腫瘤標記染色并使用熒光顯微鏡計數，能可靠地檢測出血液中的CTC，適用于臨床實驗室對轉移性乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌患者的常規評估^[23-24].且聯合抗-細胞角蛋白（CK抗體）、EpCAM抗體捕獲，能顯著提升CellSearch系統的靈敏度^[24].此外，亦有多種技術平臺基于免疫磁分選技術富集CTC，如MagSweeper^[25]、磁激活細胞分選技術（MACS）^[26].除了anti-EpCAM特異性識別分子，周朝輝等^[27]設計了anti-EGFR抗體偶聯的免疫磁珠，結合磁分選技術與免疫熒光技術實現了對非小型肺癌細胞A549的檢測.

以上方法均在體外捕獲CTC，2008年哈佛醫學院的VERMESH等^[28]開發了柔性磁力“魚線”（MagWIRE），希望能直接在患者靜脈血管中富集CTC，如圖4所示.他們選擇在活豬的耳靜脈血管中模擬“磁釣”癌細胞，MagWIRE成功捕獲了循環腫瘤細胞，并且回收了34%的免疫磁珠，該“磁釣”CTC的回收率是體外磁分選CTC的10～80倍.

中國科學院國家納米科學中心研究院PENG等^[29-31]開發了擁有獨立知識產權的新技術“腫瘤捕手”.通過篩選特異性多肽，并巧妙地組裝到納米磁珠表面，克服了抗體磁珠的位點少、方向性差、靶向性差的缺點，實現了在模擬血液中大于80%的CTC捕獲率，而傳統的抗體磁珠捕獲率僅在30%左右.2015年，中國科學院HUANG等^[32]以免疫活細胞為生物模板，并結合表面化學，仿生制備了“Smart”免疫磁珠，實現對CTC的高靶向效率，比商業化的磁珠（Dynabeads M280，Invitrogen）具有更高的捕獲率，并通過可切割的二硫鍵，按需釋放捕獲的活腫瘤細胞.

綜上所述，基于抗體-抗原識別的免疫磁分選技術具有極高的特異性，但也較為耗時耗財.由于其依賴于腫瘤細胞表面特異性抗原的表達，CTC的異質性也影響了該技術對CTC的分選效率.

1.2.2 微流控芯片技術

近年來，基于CTC物理特性和生化特性的免疫微流控芯片受到廣泛重視.2007年，NAGRATH等^[33]構筑了微柱“CTC-chip”芯片，通過化學方法將anti-EpCAM抗體修飾到微柱陣列表面，在116個癌癥患者中成功檢測出115個癌癥轉移患者，并在7例早期癌癥患者的外周血中均檢測到CTC，每毫升外周血中CTC數量在5～1 281個變化（純度為50%）.STOTT等^[34]設計的人骨形免疫（anti-EpCAM）芯片“HB-Chip”，從15位轉移性前列腺癌患者中檢測出14位的外周血中有CTC（檢出率為93%）.麻省理工學院的PARK等^[35]將金納米顆粒應用到HB-Chip芯片中（NP-^HBCTC-Chip），采用谷胱甘肽（GSH）通過化學配體交換實現競爭反應，釋放高活性的CTC，為后續的RNA基因測序等研究提供便利.改良的人骨形芯片的微通道使流體產生微渦流，以增加腫瘤細胞與芯片表面抗體的接觸機會，從而實現了高通量、高靈敏及高特異性的捕獲CTC，且能檢出之前不被重視的細胞團簇.2014年，KARABACAK等^[36]設計的CTC-iChip芯片利用確定性側向位移（DLD）原理及慣性聚焦，在一個平臺上實現兩步法分選CTC，如圖5所示.在模組1利用確定性側向位移（DLD）原理，將血液紅細胞進行分離棄除;在模組2使用磁泳法分離出CD45功能化磁珠標記的白細胞，分選CTC.CTC-iChip可處理8 mL·h^-1全血，回收（97±2.7）%的癌細胞.

此外，捕獲界面的納米結構在微流控芯片中也被廣泛研究.如利用混沌混合器使流體產生垂直流向，結合二氧化硅（SiO₂）三維納米結構高效捕獲CTC^[37].2018年CUI等^[38]通過正硅酸四乙酯原位水解法，在生物芯片表面生長SiO₂納米陣列，以促進生物芯片與CTC微絨毛及絲狀偽足之間的地形相互作用，協同特異性靶向作用捕獲CTC.實驗證明，相比光滑的表面，納米線修飾的具有納米結構的表面對CTC具有更高的捕獲率（85.4±8.3）%.如圖6所示，人體前列腺癌細胞PC-3與光滑表面的接觸面積很小，而在納米三維結構的界面上，PC-3伸出更多偽足與界面相互作用，并鋪展開來.

相比于傳統方法，微流控芯片結合親和分選方法，利用流體動力學分離細胞，具有更高的分辨率和靈敏度，易實現單個CTC分選及檢測工作，操作簡單高效，且盡可能地避免了人為誤差.但該方法與免疫磁分選類似，篩選靶向目標細胞的特異性抗體是該技術難點及瓶頸.

2 CTC的分析檢測技術

2.1 免疫熒光染色檢測

免疫熒光檢測法作為傳統CTC鑒定方法，即將熒光素偶聯的熒光抗體與腫瘤細胞進行抗體抗原特異性反應，在熒光顯微鏡下觀察，借此對腫瘤細胞進行鑒定及定位.在CellSearch系統中，通過結合CD45綠色熒光抗體（靶向白細胞）、CK8/18/19紅色熒光抗體（靶向腫瘤細胞）與細胞核DAPI藍色熒光染色劑對CTC進行熒光識別鑒定^[23-24].具有紅色和藍色熒光，無綠色熒光（CK⁺/CD45^-/DAPI⁺）的細胞鑒定為CTC，具有綠色和藍色熒光，無紅色熒光（CK^-/CD45⁺/DAPI⁺）的細胞則是白細胞，如圖7所示^[39].該方法是大部分實驗室采用的CTC鑒定方法，通過免疫熒光鑒定CTC表面相關特異性蛋白的表達.該檢測方法具有耐污染的優勢，但易產生假陽性結果，且操作復雜、耗時耗力，因此不宜大規模使用.

2.2 核酸分析檢測

近年來，基于CTC中核酸的分子分析方法被不斷開發用于CTC鑒定.定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）作為一種被廣泛使用的檢測手段，可在10⁶個白細胞的復雜背景下檢測到一個CTC，并定量CTC相關基因的表達情況.CK-19-mRNA作為CTC的特異性核酸序列，是RT-qPCR定量檢測的普遍目標^[40].STATHOPOULOU等^[41-42]采用LightCycler^TM（Roche）系統，通過優化擴增引物，實時地定量檢測外周血中CK-19-mRNA，極大提高了檢測的特異性和靈敏性.Multiplex-RT-qPCR可以在一個樣本中同時評估多個目標分子（如：EpCAM，MUC-1，HER2等），這有利于對有限的CTC進行更高靈敏度的檢測^[43]，如圖8所示.甲基化特異性基因聚合酶鏈式反應（MSP）的出現也證明了CTC多參數檢測的重要性^[44].

通過熒光素標記的DNA探針與CTC細胞核內的DNA靶序列雜交，從而獲得核內染色體或基因拷貝狀態的相關信息的熒光原位雜交（FISH）法，可用于評估乳腺癌、前列腺癌患者CTC中的HER2的表達情況^[45-46]，及ALK基因的復制數量^[47].相比于PCR，FISH具有較高的抗污染能力，且重復性好.

總之，相比于免疫熒光成像，核酸分析更客觀、可量化、成本低，不需要專門的檢驗師評估，易實現自動化及標準化.核酸檢測可以確定與治療相關的分子靶標，如：基因突變、染色體易位等，從而指導患者的個性化治療.但是，由于CTC的異質性，分子分析法無法對CTC個數進行絕對定量.

2.3 光學分析檢測

稀土發光材料的熒光信號亦被應用于CTC檢測.2015年，WANG等^[37]結合上轉換磁性復合免疫材料（NaYF₄-Fe₃O₄-Ab）及硅納米線整合的芯片，進行CTC捕獲，實現近紅外（980 nm）上轉換熒光（UCL）成像.2019年，GUO等^[48]結合時間分辨光致發光技術（TRPL技術）和稀土納米材料（NaEuF₄-Ab）溶解增強熒光放大技術，通過100 ?s的延遲，大大消除了短周期背景信號，提高了信噪比，首次實現了全血中CTC的高靈敏直接檢測，如圖9所示.

基于材料的熒光信號檢測，極大簡化了操作過程，精準靈敏，且較為客觀.但由于該方法需要對細胞進行特異性熒光材料的孵育，易造成樣品污染，細胞存活率也低.

2.4 拉曼檢測

拉曼檢測多用于分子層面的檢測，近年來，由于拉曼檢測具有信號穩定、檢測限低、靈敏度高的優勢，其在CTC檢測領域被廣泛關注.利用特異性靶向磁珠及表面增強拉曼（SERS）探針與CTC形成三明治夾結構是研究者普遍選擇的方法，實現對CTC的拉曼檢測^[49-50].XUE等^[51]則合成金納米粒子（Au NPs）包裹的超順磁性納米球（SPION-PEI），并采用巰基苯甲酸（MBA）、還原性牛血清蛋白（r-BSA）與葉酸（FA）進行層層修飾，巧妙設計了SPION-PEI @ Au NPs-MBA-r-BSA-FA復合SERS探針，實現了對宮頸癌患者的CTC（檢測限為1個·mL^-1）的捕獲檢測及釋放，如圖10所示.

研究表明，該方法有效避開了免疫熒光檢測的光降解及光漂白劣勢，靈敏度可以與RT-qPCR相媲美，制樣簡單，測量高效準確.但由于CTC在外周血中極少，這對SERS探針的設計提出了更高的要求，且設備昂貴.

2.5 其他分析檢測方法

除上述CTC檢測方法，研究者亦將電化學傳感器應用于CTC檢測.如圖11所示，HU等^[52]將通過生物模板法合成的牛血清蛋白包裹的銀納米微球（Ag@BSA）負載于金電極上，構筑了新型的細胞傳感器，靈敏檢測了人口腔表皮樣癌細胞（KB瘤細胞），實現了電化學方法檢測CTC（檢測限：20個·mL^-1KB細胞）.為提高電化學檢測靈敏度，QU等^[53]構建了一個兩種特異性適配體修飾（ss-TLS1c，ds-TLS11a）的超靈敏電化學傳感器.電化學檢測具有檢測方便、靈敏度高的優勢，且易實現便攜式儀器檢測，在CTC檢測的臨床應用中具有廣闊的應用前景.此外，其他檢測方法如酶聯免疫檢測（ELISA）也被應用于CTC檢測^[54].KIM等^[55]利用四氧化三鐵（Fe₃O₄）納米顆粒及鉑（Pt）納米顆粒的協同催化效應，將兩者負載在氧化石墨烯（GO）上，制備特異性抗體修飾的納米復合材料，通過3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺（TMB）催化顯色，實現比色檢測CTC.但該方法靈敏度有限，且對樣品純度要求高，其捕獲效率還有待提高.總的來說，以上檢測方法為CTC檢測開拓了新思路.

3 CTC檢測面臨的挑戰及展望

目前，基于腫瘤細胞的物理電學特性進行分離的技術缺乏特異性，因此聯合利用CTC的物理及生物特性，結合蛋白及核酸分析，可實現對CTC的高效精準捕獲及檢測.

然而，CTC檢測面臨的挑戰也不容忽視.首先，CTC在復雜的血液背景下，含量極少.且CTC具有異質性，沒有一種抗體能特異性100%靶向某種腫瘤細胞，只有約60%的CTC攜帶著生源實體腫瘤的生物信息.由于CellSearch僅適用于少數類型的癌癥，且檢測靈敏度不高，無法分離活的CTC，因而較大程度地限制了其在臨床檢測中的有效應用.為應對該挑戰，有研究聯合使用多種抗體，對腫瘤細胞表面抗原進行表達分型，實現更高靈敏性檢測.或是尋找新的蛋白，如肌動蛋白結合蛋白（plastin-danbai）^[56].最后，抗體定向偶聯亦是CTC檢測面臨的一項技術挑戰.抗體取向決定著抗原結合位點的活性，也就決定著材料或設備對腫瘤細胞的靶向能力^[57-58]，抑或是用分子更小的特異性靶向多肽替換抗體，實現更高靈敏度的檢測^[29-30].此外，尋找具有腫瘤特異性的其他生物標志物也是研究的熱點.腫瘤來源外泌體相比于CTC，是具有脂質雙分子層膜結構的小囊泡，結構穩定，尺寸小（30～150 nm），且量多.外泌體參與細胞通信、遷移，促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過程，與多種疾病的發生和進程密切相關^[59].2016年，在液體活檢領域，基于一種新的生物標志物，外泌體的腫瘤診斷產品首次在美國上市^[60].因此，作為CTC的替代與補充，腫瘤來源的外泌體的檢測對于腫瘤早期預警具有很大的臨床應用前景.

總的來說，CTC檢測具有很大潛力，基于理論技術和深入探索，仍有望實現對CTC的高靈敏度、高特異性、高通量及高活性的分選，達到精準檢測.

參考文獻：

[1]???? ASHWORTH T R.A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death [J].Australasian Medical Journal，1869，14：146-149.

[2]???? HOU J M，KREBS M G，LANCASHIRE L，et al.Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer [J].Journal of Clinical Oncology，2012，30（5）：525-532.

[3]???? MICALIZZI D S，FARABAUGH S M，FORD H L.Epithelial-mesenchymal transition in cancer：parallels between normal development and tumor progression [J].Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia，2010，15（2）：117-134.

[4]???? RIETHDORF S，WIKMAN H，PANTEL K.Biological relevance of disseminated tumor cells in cancer patients [J].International Journal of Cancer，2008，123（9）：1991-2006.

[5]???? VONA G，SABILE A，LOUHA M，et al.Isolation by size of epithelial tumor cells：a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulating tumor cells [J].The American Journal of Pathology，2000，156（1）：57-63.

[6]???? TIBBE A G，DE GROOTH B G，GREVE J，et al.Optical tracking and detection of immunomagnetically selected and aligned cells [J].Nature Biotechnology，1999，17（12）：1210-1213.

[7]???? ROSTAGNO P，MOLL J，BISCONTE J，et al.Detection of rare circulating breast cancer cells by filtration cytometry and identification by DNA content：sensitivity in an experimental model [J].Anticancer Research，1997，17（4A）：2481-2485.

[8]???? TAN S J，YOBAS L，LEE G Y，et al.Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood [J].Biomed Microdevices，2009，11（4）：883-892.

[9]???? HAROUAKA R A，ZHOU M D，YEH Y T，et al.Flexible micro spring array device for high-throughput enrichment of viable circulating tumor cells [J].Clinical Chemistry，2014，60（2）：323-333.

[10]???? KUO J S，ZHAO Y，SCHIRO P G，et al.Deformability considerations in filtration of biological cells [J].Lab on a Chip，2010，10（7）：837-842.

[11]???? ZHENG S，LIN H，LIU J Q，et al.Membrane microfilter device for selective capture，electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells [J].Journal of Chromatography A，2007，1162（2）：154-161.

[24]???? DENG G，HERRLER M，BURGESS D，et al.Enrichment with anti-cytokeratin alone or combined with anti-EpCAM antibodies significantly increases the sensitivity for circulating tumor cell detection in metastatic breast cancer patients [J].Breast Cancer Research，2008，10（4）：R69.

[25]???? TALASAZ A H，POWELL A A，HUBER D E，et al.Isolating highly enriched populations of circulating epithelial cells and other rare cells from blood using a magnetic sweeper device [J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106（10）：3970-3975.

[26]???? HYUN K A，LEE T Y，LEE S H，et al.Two-stage microfluidic chip for selective isolation of circulating tumor cells （CTCs） [J].Biosensors and Bioelectronics，2015，67：86-92.

[27]???? 周朝輝，付聰穎，賈能勤.基于磁分選技術和間接免疫熒光技術的肺癌 A549 細胞的分離檢測 [J].上海師范大學學報（自然科學版），2017，46（4）：489-498.

ZHOU C H，FU C Y，JIA N Q.Isolation and detection of A549 lung cancer cells based on magnetic separation and indirectimmunofluorescence technologies [J].Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2017，46（4）：489-498.

[28]???? VERMESH O，AALIPOUR A，GE T J，et al.An intravascular magnetic wire for the high-throughput retrieval of circulating tumour cellsin vivo [J].Nature Biomedical Engineering，2018，2（9）：696-705.

[29]???? PENG J，ZHAO Q，ZHENG W，et al.Peptide-functionalized nanomaterials for the efficient isolation of HER2-positive circulating tumor cells [J].ACS Applied Materials & Interfaces，2017，9（22）：18423-18428.

[30]???? BAI L，DU Y，PENG J，et al.Peptide-based isolation of circulating tumor cells by magnetic nanoparticles [J].Journal of Materials Chemistry B，2014，2（26）：4080-4088.

[31]???? XIANG Z，YANG X，XU J，et al.Tumor detection using magnetosome nanoparticles functionalized with a newly screened EGFR/HER2 targeting peptide [J].Biomaterials，2017，115：53-64.

[32]???? HUANG C，YANG G，HA Q，et al.Multifunctional “smart” particles engineered from live immunocytes：toward capture and release of cancer cells [J].Advanced Materials，2015，27（2）：310-313.

[33]???? NAGRATH S，SEQUIST L V，MAHESWARAN S，et al.Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology [J].Nature，2007，450（7173）：1235-1239.

[34]???? STOTT S L，HSU C H，TSUKROV D I，et al.Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip [J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2010，107（43）：18392-18397.

[35]???? PARK M H，REATEGUI E，LI W，et al.Enhanced isolation and release of circulating tumor cells using nanoparticle binding and ligand exchange in a microfluidic chip [J].Journal of the American Chemical Society，2017，139（7）：2741-2749.

[36]???? KARABACAK N M，SPUHLER P S，FACHIN F，et al.Microfluidic，marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples [J].Nature Protocols，2014，9（3）：694-710.

[37]???? WANG C，YE M，CHENG L，et al.Simultaneous isolation and detection of circulating tumor cells with a microfluidic silicon-nanowire-array integrated with magnetic upconversion nanoprobes [J].Biomaterials，2015，54：55-62.

[38]???? CUI H，WANG B，WANG W，et al.Frosted slides decorated with silica nanowires for detecting circulating tumor cells from prostate cancer patients [J].ACS Applied Materials & Interfaces，2018，10（23）：19545-19553.

[39]???? YOON H J，KIM T H，ZHANG Z，et al.Sensitive capture of circulating tumour cells by functionalized graphene oxide nanosheets [J].Nature Nanotechnology，2013，8（11）：735-741.

[40]???? DATTA Y H，ADAMS P T，DROBYSKI W R，et al.Sensitive detection of occult breast cancer by the reverse-transcriptase polymerase chain reaction [J].Journal of Clinical Oncology，1994，12（3）：475-482.

[41]???? STATHOPOULOU A，GIZI A，PERRAKI M，et al.Real-time quantification of CK-19 mRNA-positive cells in peripheral blood of breast cancer patients using the lightcycler system [J].Clinical Cancer Research，2003，9（14）：5145-5151.

[42]???? STATHOPOULOU A，NTOULIA M，PERRAKI M，et al.A highly specific real-time RT-PCR method for the quantitative determination of CK-19 mRNA positive cells in peripheral blood of patients with operable breast cancer [J].International Journal of Cancer，2006，119（7）：1654-1659.

[43]???? SIEUWERTS A M，KRAAN J，BOLT DE VRIES J，et al.Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR [J].Breast Cancer Research and Treatment，2009，118（3）：455-468.

[44]???? CHIMONIDOU M，KALLERGI G，GEORGOULIAS V，et al.Breast cancer metastasis suppressor-1 promoter methylation in primary breast tumors and corresponding circulating tumor cells [J].Molecular Cancer Research，2013，11（10）：1248-1257.

[45]???? DI CARLO D，IRIMIA D，TOMPKINS R G，et al.Continuous inertial focusing，ordering，and separation of particles in microchannels [J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2007，104（48）：18892-18897.

[46]???? LEVERSHA M A，HAN J，ASGARI Z，et al.Fluorescencein situhybridization analysis of circulating tumor cells in metastatic prostate cancer [J].Clinical Cancer Research，2009，15（6）：2091-2097.

[47]???? KHOO B L，WARKIANI M E，TAN D S W，et al.Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells [J].PLoS ONE，2014，9（7）：e99409.

[48]???? GUO H，SONG X，LEI W，et al.Direct detection of circulating tumor cells in whole blood using time-resolved luminescent lanthanide nanoprobes [J].Angewandte Chemie，2019，58（35）：12195-12199.

[49]???? SHA M Y，XU H，NATAN M J，et al.Surface-enhanced Raman scattering tags for rapid and homogeneous detection of circulating tumor cells in the presence of human whole blood [J].Journal of the American Chemical Society，2008，130（51）：17214-17215.

[50]???? RUAN H，WU X，YANG C，et al.A supersensitive CTC analysis system based on triangular silver nanoprisms and SPION with function of capture，enrichment，detection，and release [J].ACS Biomaterials Science & Engineering，2018，4（3）：1073-1082.

[51]???? XUE T，WANG S，OU G，et al.Detection of circulating tumor cells based on improved SERS-active magnetic nanoparticles [J].Analytical Methods，2019，11（22）：2918-2928.

[52]???? HU C Y，YANG D P，WANG Z H，et al.Bio-mimetically synthesized Ag@BSA microspheres as a novel electrochemical biosensing interface for sensitive detection of tumor cells [J].Biosensors & Bioelectronics，2013，41：656-662.

[53]???? QU L，XU J，TAN X，et al.Dual-aptamer modification generates a unique interface for highly sensitive and specific electrochemical detection of tumor cells [J].ACS Applied Materials & Interfaces，2014，6（10）：7309-7315.

[54]???? SAFAEI T S，MOHAMADI R M，SARGENT E H，et al.In situelectrochemical ELISA for specific identification of captured cancer cells [J].ACS Applied Materials & Interfaces，2015，7（26）：14165-14169.

[55]???? KIM M I，KIM M S，WOO M A，et al.Highly efficient colorimetric detection of target cancer cells utilizing superior catalytic activity of graphene oxide-magnetic-platinum nanohybrids [J].Nanoscale，2014，6（3）：1529-1536.

[56]???? YOKOBORI T，IINUMA H，SHIMAMURA T，et al.Plastin3 is a novel marker for circulating tumor cells undergoing the epithelial-mesenchymal transition and is associated with colorectal cancer prognosis [J].Cancer Research，2013，73（7）：2059-2069.

[57]???? LOU D，FAN L，CUI Y，et al.Fluorescent nanoprobes with oriented modified antibodies to improve lateral flow immunoassay of cardiac troponin I [J].Analytical Chemistry，2018，90（11）：6502-6508.

[58]???? LOU D，JI L，FAN L，et al.Antibody-oriented strategy and mechanism for the preparation of fluorescent nanoprobes for fast and sensitive immunodetection [J].Langmuir，2019，35（14）：4860-4867.

[59]???? SHARMA S，ZUNIGA F，RICE G E，et al.Tumor-derived exosomes in ovarian cancer-liquid biopsies for early detection and real-time monitoring of cancer progression [J].Oncotarget，2017，8（61）：104687.

[60]???? SHERIDAN C.Exosome cancer diagnostic reaches market [J].Nature Biotechnology，2016，34（4）：359-360.

（責任編輯：郁 慧，包震宇）

收稿日期： 2019-12-12

基金項目： 上海市地方院校能力建設專項（17070503000）

作者簡介： 蒲思思（1993—），女，碩士研究生，主要從事納米生物技術方面的研究.E-mail：Pss_Anita@163.com

通信作者： 賈能勤（1970—），男，教授，主要從事生物電化學、生物傳感器和納米生物技術方面的研究.E-mail： nqjia@shnu.edu.cn

引用格式： 蒲思思，周朝輝，賈能勤.循環腫瘤細胞分離富集與分析檢測技術的研究進展 [J].上海師范大學學報（自然科學版），2020，49（2）：219-233.

Citation format：?PU S S，ZHOU C H，JIA N Q.Research progress on isolation，enrichment and detection of circulating tumor cells [J].Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2020，49（2）：219-233.