左卡尼汀有關物質(zhì)的合成

任繼波，于建華，劉印，高瑩，楊學謙

(山東齊都藥業(yè)有限公司，山東省腦神經(jīng)保護類藥物重點實驗室，山東臨淄255400)

左卡尼汀(levocarnitine)是一種氨基酸衍生物，又稱左旋肉毒堿，化學名為(R)-3-羧基-2-羥基-N，N，N-三甲基-1-丙胺氫氧化物，結(jié)構(gòu)式見圖1，主要分布于心肌、骨骼肌中。左卡尼汀是能量代謝中必需的體內(nèi)天然物質(zhì)，其主要功能為促人體內(nèi)脂類代謝，主要生物學作用是將長鏈脂肪酸從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至人線粒體基質(zhì)，通過Krebs循環(huán)氧化產(chǎn)生ATP為細胞提供能量，并能將線粒體內(nèi)產(chǎn)生的短鏈脂酰基輸出，同時還有調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)乙酰CoA/CoA的比值、刺激肝臟生酮過程、促進蛋白質(zhì)降解、抗氧化和刺激糖原異生等作用[1]。本品的補充可緩解其因體內(nèi)缺乏引起的脂肪代謝紊亂、骨骼肌和心肌等組織的功能障礙。

左卡尼汀注射液商品名可益能(Carnitene)，由意大利Sigma-Tau公司研制，臨床上主要用于改善慢性腎衰長期血透病人因繼發(fā)性肉堿缺乏產(chǎn)生的一系列并發(fā)癥狀，臨床表現(xiàn)如心肌病、骨骼肌病、心律失常、高脂血癥，以及低血壓和透析中肌痙攣等[2-3]。

《歐洲藥典》(EP)8.0版左卡尼汀的質(zhì)量標準中提到，左卡尼汀中可能存在4個有關物質(zhì)，分別是雜質(zhì)A：(E)-或-(Z)-4-(三甲基銨基)-2-烯-丁酸內(nèi)鹽、雜質(zhì)B：(1RS，3SR)-1，2，2-三甲基-1，3-環(huán)戊烷-1，3-二羧酸、雜質(zhì) C：(2R)-N，N，N-三甲基-(4-氨基-4-氧代-2-羥基)-丁基銨、雜質(zhì)D：(E)-或-(Z)-N，N，N-三甲基-(4-氨基-4-氧代-2-烯)-丁基銨。4個有關物質(zhì)均為在左卡尼汀生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的工藝雜質(zhì)，其中雜質(zhì)B為工藝中因存在拆分消旋體步驟而使用的拆分劑，目前左卡尼汀的生產(chǎn)大多以手性化合物為起始原料，不再使用該拆分劑，故本研究中未進行雜質(zhì)B的合成研究。

4個有關物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式見圖1。

雜質(zhì)A、雜質(zhì)C和雜質(zhì)D的合成方法均未見文獻報道，只能從國外公司高價購買雜質(zhì)對照品，大大增加了左卡尼汀的質(zhì)量研究成本。本研究參考相關文獻設計合成路線，并對雜質(zhì)A、C、D進行了合成。其中雜質(zhì)A的合成以左卡尼汀為原料[4]，在乙酸中以乙酸酐為脫水劑脫水制得；雜質(zhì)C的合成以化合物1為原料[5-6]，經(jīng)胺解開環(huán)、氰基取代、鹽酸水解制得；雜質(zhì)D的合成使用雜質(zhì)A為原料[7-9]，在甲醇中與氯化亞砜反應制得相應的甲酯，然后氨解制得；雜質(zhì)A、雜質(zhì)C和雜質(zhì)D的合成路線見圖2。

1 儀器與試藥

Varian INOVA-300核磁共振波譜儀(美國瓦里安技術(shù)有限公司)；Bruker amaZon X質(zhì)譜儀(德國布魯克公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；W2RS-2目視熔點儀(上海精科儀器有限公司)；左卡尼汀、(R)-環(huán)氧氯丙烷購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乙酸、乙酸酐、氨水和氯化亞砜購于國藥集團化學試劑北京有限公司，三甲胺鹽酸鹽購于Sigma-Aldrich試劑公司，鹽酸購于萊陽市康德化工有限公司，雜質(zhì)A對照品購于歐洲藥品質(zhì)量管理局，雜質(zhì)C對照品購于加拿大TLC對照品公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 (E)-4-(三甲基銨基)-2-烯-丁酸內(nèi)鹽(雜質(zhì)A)的合成向配有磁力攪拌、溫度計和球形冷凝管的250 mL三口反應瓶中加入左卡尼汀10 g(62 mmol)、乙酸100 mL和乙酸酐19 g(186 mmol)，攪拌下加熱至回流，并攪拌回流24 h；反應結(jié)束后，將反應液55℃減壓蒸干，向蒸餾剩余物中加入甲醇100 mL和活性炭2 g，攪拌下加熱至回流，并回流1 h；過濾，濾液50℃減壓蒸干；剩余物加入無水乙醇20 mL，加熱溶解，然后冰浴降溫至10℃左右攪拌析晶1 h，過濾，濾餅50℃真空烘干2 h，得到白色固體雜質(zhì) A(3.1 g，收率34.9%)，mp：182 ℃分解。含量95.3%[HPLC外標法(雜質(zhì)A對照品購于歐洲藥品質(zhì)量管理局)：色譜柱以氨基鍵合硅膠為填充劑(3.9 mm×300 mm，10μm)；以磷酸二氫鉀溶液(6.81 g·L-1的磷酸二氫鉀溶液，用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.7)-乙腈(35∶65)為流動相；流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；檢測波長205 nm]。 MS(m/z)：144.1[M+H]+；1H-NMR(CD3OD，300 MHz)δ：3.13(9H，s，-CH3)，4.03～4.06(2H，d，J＝7.5Hz，-CH2)，6.28～6.33(1H，d，J＝15.3 Hz，＝CH-C＝O)，6.48～6.59(1H，m，＝CH-)；13C-NMR(CD3OD，300 MHz)δ：52.1(3C)，66.6，125.8，140.6，171.7。

2.2 (S)-3-氯-2-羥基-N，N，N-三甲基-1-丙胺氯化物(2)的合成 向配有磁力攪拌、溫度計和恒壓滴液漏斗的100 mL三口反應瓶中加入三甲胺鹽酸鹽12.4 g(130 mmol)和純化水50 mL，攪拌，控制溫度40℃以下滴加化合物1[(R)-環(huán)氧氯丙烷]10 g(108 mmol)，加完后控溫40～45℃反應4 h；將反應液55℃減壓蒸去水，并用無水乙醇 20 mL帶水，得到化合物2的粗品；向所得的化合物2的粗品中加入甲醇30 mL，攪拌下加熱至回流，固體全部溶解后，自然降至室溫，然后用冷凍水降溫至0～5℃析晶2 h，過濾，濾餅50℃鼓風烘干2 h，得到化合物2(13.3 g，收率65.5%)。

2.3 (R)-3-氰基-2-羥基-N，N，N-三甲基-1-丙胺氯化物(3)的合成 向配有磁力攪拌、溫度計的100 mL反應瓶中加入化合物2 13.0 g(69 mmol)和甲醇50 mL，攪拌下加熱至50℃使化合物2完全溶解，分批加入氰化鈉3.7 g(76 mmol)，加完后控溫50～55℃反應6 h；將反應液降溫至20～25℃，反應液過濾，濾液50℃減壓蒸干，向蒸餾剩余物中加入無水乙醇50 mL，降溫至0～5℃攪拌1 h，過濾，濾餅50℃鼓風烘干2 h，得到化合物 3(10.1 g，收率82.1%)。

2.4 (2R)-N，N，N-三甲基-(4-氨基-4-氧代-2-羥基)-丁基銨氯化物(雜質(zhì)C鹽酸鹽)的合成 向配有磁力攪拌和溫度計的50 mL反應瓶中加入化合物3[(R)-3-氰基-2-羥基-N，N，N-三甲基-1-丙胺氯化物]5 g(28 mmol)和濃鹽酸12.5 mL(150 mmol)，控溫20～25℃攪拌反應48 h；反應結(jié)束后，過濾，濾液55℃減壓蒸干，剩余物加入90%乙醇100 mL，加熱至70℃攪拌至溶解，攪拌下降溫至10～20℃析晶2 h，過濾，濾餅50℃真空烘干4 h，得到白色固體雜質(zhì)C鹽酸鹽(3.3 g，收率60.0%)，mp：214～216℃。 含量97.5%[HPLC 外標法(雜質(zhì)C對照品購于加拿大TLC對照品公司)：色譜柱以氨基鍵合硅膠為填充劑(3.9 mm×300 mm，10μm)；以磷酸二氫鉀溶液(6.81 g·L-1的磷酸二氫鉀溶液，用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH值至4.7)-乙腈(35∶65)為流動相；流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；檢測波長 205 nm]。 MS(m/z)：161.1 M+；1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：2.24～2.30(2H，dd，J＝2.4，6.6 Hz，-CH2)，3.15(9H，s，-CH3)，3.34～3.36(2H，d，J＝5.7 Hz，N-CH2)，4.40～4.46(1H，m，-CH-)，5.74～5.76(1H，d，J＝5.7 Hz，-OH)，6.99、7.54(2H，s，-NH2)；13C-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：41.8，54.1(3C)，63.3，70.3，172.1。

2.5 (E)-N，N，N-三甲基-(4-氨基-4-氧代-2-烯)-丁基銨(雜質(zhì)D)的合成 向配有磁力攪拌、溫度計和恒壓滴液漏斗的100 mL反應瓶中加入雜質(zhì)A 2 g(14 mmol)、甲醇20 mL，攪拌降溫至10℃以下，控溫10℃以下滴加氯化亞砜8.3 g(70 mmol)，然后升溫至20～25℃反應20 h，反應結(jié)束后，將反應液40℃減壓蒸干，剩余物加入氨水4.5 mL，20～25℃攪拌4 h，反應結(jié)束后，反應液50℃減壓蒸干，所得油狀物通過柱色譜[洗脫劑：二氯甲烷：甲醇(5∶1)]純化，得到類白色固體，即為雜質(zhì) D(1.2 g，收率60.0%)，mp：191 ℃分解。 純度99.6%[HPLC面積歸一化法：色譜柱以氨基鍵合硅膠為填充劑(3.9 mm×300 mm，10μm)；以磷酸二氫鉀溶液(6.81 g·L-1的磷酸二氫鉀溶液，用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.7)-乙腈(35∶65)為流動相；流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；檢測波長205 nm]。 MS(m/z)：143.1 M+；1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：3.11(9H，s，-CH3)，4.18～4.21(2H，d，J＝7.5Hz，-CH2)，6.29～6.34(1H，d，J＝15Hz，＝CH-C＝O)，6.68～6.78(1H，m，＝CH-)，7.32，8.03(2H，s，-NH2)；13C-NMR(DMSO-d6，300 MHz) δ：52.8(3C)，65.7，129.1，135.4，166.0。

3 討論

3.1 本文報道了左卡尼汀中主要存在的3個雜質(zhì)的合成方法。雜質(zhì)A有E構(gòu)型和Z構(gòu)型兩種構(gòu)型的異構(gòu)體，其中E構(gòu)型比較穩(wěn)定，在反應得到的粗品中占約90%以上，通過無水乙醇重結(jié)晶，可以將Z構(gòu)型雜質(zhì)A完全去除，得到E構(gòu)型的雜質(zhì)A，并通過高效液相色譜和核磁共振氫譜的檢測結(jié)果，確認了得到的雜質(zhì)A為E構(gòu)型。雜質(zhì)C合成的關鍵步驟是化合物3的氰基在鹽酸中水解步驟，氰基在鹽酸中先水解為酰胺，酰胺繼續(xù)水解為酸；在試驗中發(fā)現(xiàn)反應溫度高會造成副產(chǎn)物(酸)的比例增多，造成產(chǎn)品的含量降低，所以在雜質(zhì)C的制備中，需要嚴格控制鹽酸水解步驟的反應溫度為20～25℃，以減少副產(chǎn)物的生成。雜質(zhì)D同雜質(zhì)A一樣，有E構(gòu)型和Z構(gòu)型兩種異構(gòu)體，本研究使用E構(gòu)型的雜質(zhì)A來制備雜質(zhì)D，得到E構(gòu)型的雜質(zhì)D。

3.2 目前沒有文獻報道左卡尼汀雜質(zhì)A、雜質(zhì)C和雜質(zhì)D的合成方法，而在左卡尼汀的質(zhì)量研究和穩(wěn)定性考查過程中，需要用到上述3個雜質(zhì)的對照品，只能從國外高價購買，造成研究費用明顯增加。本文研究并合成了上述3個雜質(zhì)，各雜質(zhì)含量或純度均在95%以上，可以作為雜質(zhì)對照品使用，同時各雜質(zhì)合成所使用的試劑價格低廉，雜質(zhì)的合成成本較低，有效降低了左卡尼汀的研發(fā)成本。