水稻細菌性條斑病菌侵染后抗、感近等基因系內源激素含量的變化

何圣賢，萬 瑤，覃雪梅，張 慧，劉 芳

（廣西大學農學院/亞熱帶農業生物保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004）

【研究意義】水稻細菌性條斑病（bacterial leaf streak，BLS），簡稱細條病，是由水稻細條 病 病 菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzicola，Xooc）感染引起，該病菌為革蘭氏陰性、黃單胞菌屬細菌[1]。是我國南方稻區主要的檢疫性病害之一[2-3]，是繼水稻稻瘟病、水稻紋枯病和水稻白葉枯病之后的第四大病害[4]，1957年在我國廣東省發現該病害[5]。病菌的侵染能引起植物一系列生理代謝過程的變化，進而導致各種癥狀[6]，而植物激素的變化可能與病害癥狀形成有關[7]。因此，研究水稻感染細條病菌后激素的變化可為揭示水稻與病原菌互作機制提供依據，同時為水稻抗性育種提供參考。【前人研究進展】大量研究表明，在植物與病原物互作過程中水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ETH）發揮了關鍵作用[8-10]。一般認為SA主要調控植物對活體營養型病原菌的抗性，而JA和ETH主要調控植物對死體營養型病原菌的抗性[11]。植物生長發育相關的激素，如赤霉素（GA）、細胞分裂素（CTK）、脫落酸（ABA）、生長素（IAA）等也直接或間接地參與了植物抗病或感病反應[12]。激素合成代謝與信號轉導途徑是如何調控水稻抗病性的，也引起重視。研究表明SA的信號途徑在介導水稻防衛反應中起重要作用[13]，其中兩個關鍵調控基因OsNPR1和OsWRKY45在水稻SA途徑中具有不同而又互補的作用[14]。許多研究表明JA參與水稻免疫反應[15-16]。Riemann等[17]通過對JA合成途徑關鍵基因OsAOC缺失突變體的研究發現，OsAOC突變后對稻瘟菌的抗性降低，JA介導了對稻瘟菌的防衛反應。Uji等[18]發現水稻OsMYC2作為早期JA信號的正調控因子，能夠與JA反應的轉錄抑制子JAZ互作，OsMYC2在水稻過表達后，通過上調防御相關基因的表達，增強了對白葉枯病菌的抗性。Grewal等[19]利用微陣列研究白葉枯病菌觸發的水稻轉錄調控時發現，大量乙烯信號相關基因參與水稻免疫調節。Qin等[20]在研究赤霉素20-氧化酶基因OsGA20ox3過表達和RNAi轉基因植株時發現，通過調節GA含量，可以改變水稻對白葉枯病菌和稻瘟病菌的抗性。Jiang等[21]測定了稻瘟病菌侵染后苗期水稻葉片內植物激素的含量，發現CTK在葉片內積累，并證實CTK信號與SA信號協同參與水稻對稻瘟病菌的數量抗性調控。【本研究切入點】雖然在水稻與病原菌互作過程中植物激素功能的研究已取得一定進展，但是多集中于稻瘟病菌和白葉枯病菌的研究。對于各類植物激素在水稻抵抗細條病菌中所扮演的角色，還缺乏認識，關于Xooc侵染后植株內源激素的變化仍少見報道。【擬解決的關鍵問題】通過測定Xooc侵染水稻細條病抗、感近等基因系后SA、JA、ETH、GA、玉米素（ZT）在不同時間點的葉片內含量，并與接種無菌水的對照進行比較，明確Xooc侵染對水稻植株內源激素的影響，為研究和防治水稻細條病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 水稻材料 以感病秈稻品種9311為輪回親本，抗病野生稻材料DY19為供體親本，通過雜交、回交和自交培育BC4 F3代，獲得水稻細條病抗病近等基因系LR19和感病近等基因系LS19。2019年9月在廣西大學農學院科學研究試驗基地種植LR19和LS19各100株。

1.1.2 供試菌株 水稻細條病菌（Xooc）采用廣西水稻細條病優勢生理小種 GX01，由亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室何勇強教授提供。

1.2 試驗方法

2 結果與分析

2.1 SA含量變化

從圖1可以看出，接菌0 h，抗病近等基因系LR19較感病近等基因系LS19的SA含量高，前者 SA 含量（10.05 μg/mL）是后者（7.11 μg/mL）的1.48倍。接菌0～96 h，LR19處理組與對照組SA含量整體都呈下降趨勢，且在各時間點，接菌處理和對照間差異不顯著；接菌0～24 h，LS19處理組與對照組SA含量緩慢上升，并在接菌24 h同時達到峰值，分別為7.61、8.16 μg/mL，接菌24～96 h又皆呈下降趨勢，但對照組下降速率更快，而處理組則稍慢。從總體上看，接種0～96 h期間SA含量，LR19和LS19處理組分別為8.32、6.57 μg/mL，對照組分別為8.31、6.27 μg/mL。抗性材料SA含量始終高于感性材料，但兩個材料處理組與對照組相比均無顯著差異。表明SA含量的變化并不是由Xooc的侵染引起的。

圖1 抗、感近等基因系接種細條病菌后不同時間葉片SA含量的變化Fig.1 Changes of SA content in leaves of resistant and susceptible near-isogenic lines at different times after Xooc inoculation

2.2 JA含量變化

由圖2可知，接菌0 h，LR19和LS19葉片JA含量差異不大，前者為1 579.33 pmol/L，后者為1 418.5 pmol/L；接菌24～96 h，LR19和LS19葉片JA含量都升高，而前者JA含量要低于后者。接菌0～24 h，LR19處理組葉片JA含量迅速升高，并達到峰值（2 891.0 pmol/L），較對照（939.33 pmol/L）增加207.77%，差異顯著；接菌24～96 h，JA含量隨著時間延長而減少，接菌96 h，處理組（2 022.67 pmol/L）較對照組（679.33 pmol/L）增加197.74%，差異顯著；接菌0～48 h，LS19處理組葉片JA含量一直保持較高的上升速率，并在接菌48 h達到峰值（4 180.17 pmol/L），較對照（991.83 pmol/L）增加321.46%，差異顯著；接菌96 h，處理組葉片JA含量有所下降（3 506.83 pmol/L），較對照（725.17 pmol/L）仍保持較高水平，增加比率達到383.59%（P＜0.05）。從總體上看，接菌0～96 h期間JA含量，LR19處理組和對照組分別為2 316.0、1 174.33 pmol/L；LS19處理組和對照組分別為3 043.08、971.83 pmol/L。抗、感材料處理組與對照組相比差異顯著，細條病菌侵染后，誘導抗、感病近等基因系葉片JA含量上升，JA參與了水稻與細條病菌的互作。

圖2 抗、感近等基因系接種細條病菌后不同時間葉片JA含量的變化Fig.2 Changes of JA content in leaves of resistant and susceptible near-isogenic lines at different times after Xooc inoculation

2.3 ETH含量變化

圖3 抗、感近等基因系接種細條病菌后不同時間葉片ETH含量的變化Fig.3 Changes of ETH content in leaves of resistant and susceptible near-isogenic lines at different times after Xooc inoculation

由圖3可知，接菌0 h，LR19和LS19葉片ETH含量分別為224.04、166.02 nmol/L，前者是后者的1.35倍，二者之間差異顯著；接菌24 h，LR19處理組（192.31 nmol/L）較對照組（278.57 nmol/L）ETH含量減少，減少比率為30.97%，差異顯著；接菌24～96 h，處理組ETH含量呈波動趨勢，而對照組ETH含量則趨于穩定；接菌0～24 h，LS19處理組葉片ETH含量降低，并在接菌24 h后趨于穩定，且始終低于對照，但是與對照相比沒有顯著差異。從總體上看，接菌0～96 h，LR19和LS19葉片 ETH含量，處理組分別為220.06、128.32 nmol/L，對照組分別為280.56、144.7 nmol/L，抗病近等基因系高于感病近等基因系，但兩個材料ETH含量處理組與對照組間差異未達顯著水平。表明ETH含量的變化并不是由Xooc的侵染引起的。

2.4 GA含量變化

由圖4可知，接菌0 h，LR19葉片GA含量（76.78 pmol/L）略低于 LS19（81.98 pmol/L），但差異不顯著。接菌24 h，LR19處理組葉片GA含量（74.92 pmol/L）較對照組（62.39 pmol/L）增加比率為20.08%；接菌24～48 h，GA含量迅速下降并于接菌96 h達到最低值（42.34 pmol/L），較對照組（88.62 pmol/L）減少52.22%，差異顯著；接菌24 h，LS19處理組葉片 GA含量升高至峰值（89.51 pmol/L），較對照組（72.25 pmol/L）增加23.89%，接菌24 h后，GA含量開始下降，接菌96 h下降至最低值（74.43 pmol/L），但與對照組（42.64 pmol/L）差異仍顯著。從總體上看，接菌0～96 h期間GA含量，LR19處理組和對照組分別為63.81、75.19 pmol/L，LS19處理組和對照組分別為83.20、66.27 pmol/L，抗、感材料處理組與對照組相比差異顯著，細條病菌侵染后，抗、感近等基因系葉片GA含量變化不同，前者下調，后者上調，表明GA參與了水稻與細條病菌的互作。

圖4 抗、感近等基因系接種細條病菌后不同時間葉片GA含量的變化Fig.4 Changes of GA content in leaves of resistant and susceptible near-isogenic lines at different times after Xooc inoculation

2.5 ZT含量變化

由圖5可知，接菌0 h，LR19和LS19葉片ZT含量分別為6.35、4.84 pmol/L，前者是后者的1.33倍。LR19處理組葉片ZT含量在接菌48 h降到谷值（4.62 pmol/L），較對照（5.64 pmol/L）減少比率為18.09%，接菌48～96 h，ZT含量表現為上升趨勢，但始終低于對照；LS19處理組葉片ZT含量在接菌24 h降到最低（3.76 pmol/L），較對照（5.24 pmol/L）減少比率為28.24%，差異顯著，接菌48 ～96 h，ZT含量上升，但與對照相比差異不顯著。從總體上看，接菌0～96 h，LR19和LS19 葉片ZT含量，處理組分別為5.56、4.37 pmol/L，對照組分別為6.40、4.96 pmol/L，抗病近等基因系高于感病近等基因系，但兩個材料ZT含量處理組與對照組間差異不顯著。表明ZT含量的變化并不是由Xooc的侵染引起的。

圖5 抗、感近等基因系接種細條病菌后不同時間葉片ZT含量的變化Fig.5 Changes of ZT content in leaves of resistant and susceptible near-isogenic lines at different times after Xooc inoculation

3 討論

植物激素作為一種天然存在的小的有機分子，不僅對植物的發育過程有重要作用，而且在植物的防御和免疫反應中起著重要的信號分子作用[22-23]。許多最初被認為只與生長過程有關的激素，現在已被認為與對病原體的免疫反應有關[24]。不是由一種激素控制植物免疫的，植物激素通過復雜的拮抗和協同作用相互依賴。植物激素信號通路之間的復雜交流網絡被稱為激素交聯。植物激素積累動態影響著由某一特定植物激素介導的信號輸出，以及由此產生的激素交聯。因此，測量植物激素濃度，對于理解激素交聯至關重要[10]。目前參與防御水稻細條病菌的激素及其信號轉導網絡尚不清楚，本研究測量水稻細條病抗、感近等基因系受Xooc侵染后，5種激素濃度在不同時間點的變化，將有助于對這一問題的認識。

水楊酸（SA）在植物防衛反應的信號途徑和獲得性抗性（systemic acquired resistance,SAR）方面起著重要作用[13]。水稻植株內源基礎 SA含量相對較高，其占植株鮮重的比例大致為5 000～30 000 ng/g，甚至比受侵染的煙草、擬南芥等植物組織還要高，高含量的SA可充當內源抗氧化劑，為水稻提供保護，不受由病原菌侵染、非生物脅迫和老化引起的損傷[25-28]。然而，SA參與水稻防御更依賴于SA信號傳導而不是其內源水平或從頭合成的變化[15]。本研究中，接菌Xooc后，抗病近等基因系體內SA含量遠高于感病近等基因系，此后，二者中的JA含量均呈下降趨勢，但與對照組相比均無顯著差異。表明SA含量的變化并不是由Xooc的侵染而引起的。但是在接菌0～96 h，抗病近等基因系SA含量始終高于感病近等基因系，這種高的內源基礎SA含量，是否是產生細條病抗性所需要的，還有待進一步研究。

茉莉酸（JA）在植物遭受病原菌入侵時起著重要的保護作用，當病原菌入侵后，植物通過JA信號傳遞，能夠對病原菌的脅迫作出防衛反應[29-30]。越來越多的證據表明，在水稻中JA是個強大的信號，能夠抵抗各種不同生活方式的病原菌，包括半活體營養型白葉枯病菌、活體營養型稻瘟病菌和死體營養型紋枯病菌[16]。本試驗中，細條病菌侵染后，誘導抗病近等基因系和感病近等基因系葉片內的JA含量上升，而接種無菌水的對照，抗病近等基因系和感病近等基因系葉片內的含量均沒有上升，在各時間點，處理組與對照組間差異顯著。表明，Xooc能夠誘導JA含量的增加。Feng等[31]研究表明OsPGIP4正向調控水稻對細條病菌的防衛反應，而JA可能參與OsPGIP4介導的防衛反應。Ke等[32]研究發現，水稻的植物抗毒素蛋白基因OsPAD4誘導的對白葉枯病菌和半活體營養型細條病菌的抗性，并不依賴SA反應，而是與JA的積累和JA響應基因的表達有關。本研究結果同樣提示JA可能參與了水稻與細條病菌的互作。而在接菌24～96 h，抗病近等基因系的JA含量低于感病近等基因系，可能是因為抗病近等基因系產生抗性需要JA參與反應或信號介導而消耗所致。

ETH與JA信號具有協同作用[10]。其作為水稻防御信號的雙向調節因子，增強了對稻瘟病等病原菌的抗性，而導致對白葉枯病菌的敏感性，正負調控作用取決于病原體的感染生物學[33]。本試驗中，抗、感近等基因系接種細條病菌后，葉片ETH含量與對照組差異不顯著。表明ETH含量的變化并不是由Xooc的侵染引起的。接菌0～96 h，抗病近等基因系ETH含量始終高于感病近等基因系，這有可能與細條病抗性差異相關。

赤霉素（GA）是一個四環二萜類激素的大家族，有助于調節植物生長和免疫反應[34]。Yang等[35]研究表明，GA負調控水稻的基礎抗病性。外施GA和GA合成抑制劑可分別提高白葉枯病的敏感性和抗性。相似地，生物合成基因OsGA20Ox3的轉錄增加也導致對白葉枯病菌和稻瘟病菌敏感性的增強[20]。本研究接菌后，抗病近等基因系葉片GA含量較對照下降；而感病近等基因系葉片GA含量較對照上升。受Xooc侵染后，抗、感系葉片GA含量變化不同。從而推測GA在水稻抗細條病的過程中可能發揮著負調控的作用。

玉米素（ZT）是一種植物體內天然存在的細胞分裂素，不僅能促進植物細胞分裂，而且可以阻止葉綠素和蛋白質降解，減慢呼吸作用，延緩植株衰老。細胞分裂素對活體營養型病原菌的免疫具有正負調節雙向作用，取決于侵染部位細胞分裂素濃度的高低。高水平的細胞分裂素導致病原菌生長減少和防御反應的激活，而低濃度的細胞分裂素促進病原菌生長[36]。細胞分裂素對活體營養型病原菌的重要性要超過細菌和真菌/卵菌病原體[9]。本試驗中，抗、感近等基因系葉片ZT含量雖在接菌處理后表現為下降，但是從整體上看，與對照相比均無顯著差異。表明ZT含量的變化，并不是由Xooc侵染引起的。而抗病近等基因系ZT含量始終高于感病近等基因系，這可能有助于抵抗細條病。

4 結論

試驗結果表明，接菌后，LR19處理組SA、ETH、ZT含量分別為8.32 μg/mL、220.06 nmol/L和5.56 pmol/L，對照組則分別為8.31 μg/mL、250.86 nmol/L和6.40 pmol/L。LS19處 理組 SA、ETH、ZT含 量 分 別 為 6.57 μg/mL、128.35 nmol/L和4.37 pmol/L，對照組則分別為 6.27 μg/mL、134.7 nmol/L 和 4.96 pmol/L。對于這3種激素，抗、感材料在處理組和對照組間差異均不顯著，表明它們的變化不是由Xooc引起的，但是抗性材料SA、ETH、ZT含量始終高于感性材料，可能有助于抵抗病原菌的侵染。接菌后，LR19處理組JA、GA含量分別為2 316.0、63.81 pmol/L，對照組則分別為1 174.33、75.19 pmol/L，LS19處理組JA、GA含量分別為3 043.08、83.20 pmol/L，對照組則分別為971.83、66.27 pmol/L。對于這2種激素，抗、感材料在處理組和對照組間差異顯著，且抗性材料的含量低于感性材料。表明它們的變化是由Xooc引起的，JA和GA參與了水稻對細條病的抗性反應。