三種常見品牌護膚品暴露對鯪肝臟SOD和GST活性、GSH含量的影響

傅小嬌, 何世興, 鄭超, 余琳, 李漢邯, 楊占彪, 徐小遜, 程章

三種常見品牌護膚品暴露對鯪肝臟SOD和GST活性、GSH含量的影響

傅小嬌, 何世興, 鄭超, 余琳, 李漢邯, 楊占彪, 徐小遜, 程章*

四川農業大學環境學院, 溫江, 611100

研究護膚品暴露對鯪()的毒性效應, 為護膚品的安全使用和污染控制提供科學依據。配置不同濃度(0 g·L–1、0.5 g·L–1、0.75 g·L–1、1.00 g·L–1)的護膚品暴露鯪48h, 在暴露時間為0、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h時, 測定鯪肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽轉移酶(GST)活性、谷骯甘肽過氧化物酶(GSH)含量, 觀察并記錄鯪的死亡情況, 計算三種護膚品對鯪的半致死濃度(LC50)。結果表明: 三種護膚品的暴露濃度為1.00 g·L–1時, SOD酶和GST酶活性達到最大; 三種酶活性都是隨著時間的增加呈現先增后減的變化規律; 護膚品B、C暴露48h時, GSH酶被抑制; 護膚品A、B、C 48h 的LC50分別為807 mg·L–1、973 mg·L–1和1147 mg·L–1。護膚品 A、護膚品 B 和護膚品C的毒性分別為中毒物質, 中毒物質和低毒物質, 中高價位的護膚品對鯪的傷害相對較小。

護膚品; 鯪; 暴露; 酶活性; 毒性效應

0 前言

藥物及個人護膚品(Pharmaceutical and Personal Care Products, PPCPs)是與人類生活密切相關的一類有機合成物質的總稱, 包含藥品(獸類醫藥、人類服用醫藥)以及個人護理品兩大類[1-2]。近年來, 個人護理品中的護膚品行業發展迅速, 各種效果的護膚品層出不窮, 已成為現代女性必不可少的物品之一。Reiner等發現一些個人護理品中含有加樂麝香[3]。麝香類物質對斑馬魚()的繁殖和早期生存有負面影響[4]。Wang[5]發現護膚品中會添加重金屬、遮光劑等特殊物質, 這些成分一旦進入水體后, 不易被去除, 并易在環境生物中富集, 對動物及其他生物產生持久的污染效應。魚類對有毒有害物質有較強的蓄積能力, 在這些有害物質的暴露下, 魚體各組織器官中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽轉移酶(GST)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)等抗氧化酶的活性以及總抗氧化能力發生改變, 一定程度上能反映出機體在污染環境下的生理生化狀態, 從而反映環境質量變化對生物的毒性效應, 所以魚類可作為水體中一些污染物的早期生物監測指標[6]。

我國是護膚品的生產和使用大國, 據報告顯示2020年的護膚品市場容量超過12000億元[7]。目前, 我國也開始對環境中個人護理品的污染狀況進行了研究[8-10], 但對其生態風險評價方面的研究較少, 尤其對不同價位的護膚品對魚類影響的研究較少。鯪()隸屬于鯉科、鯪屬, 系一種亞熱帶雜食性底層魚類, 具耐密養、病害少、生長快速、養殖周期短等優點, 且具有對多種農藥、重金屬[11]等毒物較敏感等特征, 主要分布在珠江水系、海南島、臺灣、瀾滄江和元江一帶, 是水環境監測和毒理性試驗的理想試驗動物。

本文利用鯪在三種不同價位的護膚品暴露下對SOD、GSH、GST酶活性的影響, 評價不同價位的護膚品不同濃度暴露對鯪的毒性效應, 為日常生活中護膚品的選擇提供參考建議。

1 材料與方法

1.1 供試材料

(1)鯪, 購自珠江水產研究所, 體長4—5 cm, 體重1.8—2 g, 馴養于曝氣48 h以上的自來水中, pH= 7.5, 溫度為(23±2) ℃, 自然光照, 實驗魚種在護膚品暴露前先在實驗條件下馴養1周。

(2)護膚品: 護膚品A(低價位, 約20—50元), 護膚品B(中價位, 約50~—200元), 護膚品C(高價位, 500元以上)。

1.2 試驗設計

1.2.1 預備試驗

2018年10月8日在四川農業大學生態毒理實驗室放置體積為10 L的玻璃水缸, 其中加入曝氣一周的自來水, 每缸放入30尾鯪, 試驗期間水溫控制在23—26 ℃, 溶氧6 mg·L–1以上, 連續充氣, pH值為6.8—7.2。溶解三種護膚品, 控制5個間隔較大濃度梯度及空白組共4組, 設置3個實驗重復。實驗開始后第0、6、12、24、36、48 h時觀察并記錄各水缸中鯪的存活情況。

1.2.2 急性毒性試驗

試驗在10L的水缸中進行, 設置3個處理組(0.50 g·L–1、0.75 g·L–1、1.00 g·L–1)及其相對應的空白對照組, 每個處理設3個平行, 每缸40尾魚。實驗開始后于0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h從各濃度水缸中取3尾活魚樣, 分別解剖取其肝臟混為1個樣品, 立即放入- 80 ℃超低溫冰箱冷凍待測。

1.3 測定方法

粗酶液的制備于試驗當天將冷凍的肝臟取出, 在經-20 ℃預冷的研缽中加入少許石英砂和3.0 mL Tris 2蔗糖緩沖液,研碎后轉入離心管, 10000 r·min–1離心15 min, 上清液即為粗酶液, 用于酶活性的測定, 每個樣品測定4次。

SOD活性的測定: 采用鄒國林[12]等改進后的鄰苯三酚自氧化法對SOD 活性進行定, 活性單位為: 將一定條件下使每毫升反應液自氧化速率抑制50%的酶量為一個單位(U)。

GSH含量的測定: 酶標儀(購自上海菁華科技儀器有限公司)測定GSH含量(GSH檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所); 單位為: 每克酶樣品37 ℃每分鐘催化1 μmol GSH氧化的酶量。

GST活性的測定: 參照梁惜梅[13]的方法進行測定。GST活性單位定義:每毫克組織蛋白在37 ℃反應1 min扣除非酶促反應,使反應體系中GSH濃度降低1 μmol·L–1為1個酶活性單位(U·mg–1)。試驗過程中用到的各種型號槍頭、EP管、解剖剪、鑷子等均需高溫高壓、干燥處理, 以減少污染。

1.4 數據處理

采用Origin 9.1軟件進行作圖及SPSS 24.0統計軟件對所得數據進行統計學分析, 進行相關性分析及單因素方差分析(One way ANOVA)。

2 結果與討論

2.1 三種護膚品暴露對鯪SOD酶活性的影響

圖1為三種護膚品對鯪SOD酶活性的影響。濃度和時間是影響酶活性變化的重要因素。在時間-效應關系方面, 鯪SOD酶活性先增加后降低, 在時間為12 h時, 達到最大值, 約為對照組的5倍。在時間為6 h時, 酶活性最小, 約為對照組的2倍。在護膚品A與B暴露濃度為1.00 g·L–1下, SOD酶活性分別達到41.4 U·mg–1和37.56U·mg–1, 顯著高于護膚品C的作用。12 h后隨著時間的增加, SOD酶活性減少, 但也顯著高于對照組, 酶活性沒有受到抑制。

濃度-效應方面, 護膚品A暴露鯪6 h、12 h、24 h、36 h和48 h時間段, 鯪SOD酶活性隨著濃度的升高而增加, 在濃度為1.00g·L–1時達到最大值(圖1a); 護膚品B暴露鯪6 h、12 h、24 h和36h時間段, 鯪SOD酶活性隨著濃度的升高而增加, 在48 h時, 酶活性無顯著差異(<0.05)(圖1b); 在護膚品C暴露下, SOD酶含量先隨著濃度的增加而增加, 在暴露12 h后, 隨著濃度的增加, SOD酶活性無顯著差異(<0.05)(圖1c)。

SOD酶普遍存在于水產動物體內, 是生物體內一種以自由基為底物的抗氧化酶, SOD酶能專一地清除體內有害的自由基[14], 以解除自由基氧化體內的某些組成成分而造成的機體損害, 常作為評價外源化合物產生氧化脅迫的重要生物標志物[15]。SOD酶的主要功能是將活性更強的超氧化離子(O2·-)歧化為活性更弱的H2O2, 隨后H2O2被其他在細胞質或其他細胞器中的酶分解為水和氧氣。研究中三種護膚品的暴露對鯪的SOD酶活性產生一定的誘導作用, 在暴露24 h后, 誘導作用逐漸減弱。有研究表明72% PPCPs能夠使細胞膜上的過氧化脂質增加, 其基本氧化還原成份能通過影響肝細胞的氧化代謝作用進而導致氧化性損傷[16]。暴露初期, SOD酶活性增加來清除護膚品存在的有害基質, 隨著時間的變化機體的酶合成受到抑制, SOD酶活性降低。本研究表明, 經過 48 h暴露, 在較低濃度下(0.50 g·L–1)即可造成對鯪抗氧化系統的氧化脅迫, SOD酶對護膚品污染均十分敏感。其中護膚品A暴露對鯪的酶活性影響最大, 其次是護膚品B, 影響最小的是護膚品C, 說明中高價位的護膚品可能所含有害自由基相對較少。

注: a是化妝品A, b是護膚品B, c是護膚品C; 不同大寫字母表示時間-酶活性差異顯著; 不同小寫字母表示濃度-酶活性差異顯著。

Figure 1 Effects of skin care products on the activity of SOD enzyme in

2.2 三種護膚品暴露對鯪GST酶活性的影響

三種護膚品暴露對鯪GST酶活性影響如圖2所示。在時間-效應方面, 隨著時間的累積, GST酶活性都處于誘導狀態。整個實驗過程中, 在三種護膚品暴露作用下, 暴露時間在6 h到12 h時間段, GST酶活性均顯著高于其他實驗組, 在暴露時間6h時候酶活性最大。護膚品不同濃度暴露, GST含量均顯著高于對照組, 當濃度為1.00 g·L–1時, 酶活性被誘導最顯著(<0.05)。隨著濃度的增加, 使得機體產生更多的酶去消除護膚品暴露帶來的有害物質, 所以在護膚品A暴露下(圖2a), GST酶活性隨著濃度的增加而增加。護膚品B暴露36 h過程中(圖2b), GST酶活性隨著濃度的增加而增加。護膚品C暴露24 h、36 h和48 h時(圖2c), GST酶活性也隨著濃度的增加而增加。

GST是生物體內解毒系統第二階段的解毒酶。它可保護DNA及一些蛋白質免受損傷, 而且可與一些難溶于水的膽酸和激素等外源或內源的代謝產物反應, 生成一些水溶性的化合物, 然后排出體外[17], 達到消除生物體內存在的自由基和解毒的效果。同時, GST酶可催化谷胱甘肽(GSH)酶清除體內有害的親電基團。圖2(a, b, c)中GST活性都高于對照組, 說明在護膚品48 h的暴露下, 鯪GST活性都是處于被誘導的狀態, 來抵御外源污染物的危害, 而后隨著暴露的時間的延長, 護膚品中有毒有害物質在肝臟中富集量的增加, GST酶活性降低。柏世軍[18]等的研究也獲得了近似的結果, 3.00 mg·L–1Cr2+暴露羅非魚(), 前20 d GST酶也是處于持續誘導, 隨著脅迫作用時間的延長, 由于GSH的耗竭所致, 肝臟受到了嚴重的氧化損傷, GST酶失活。護膚品A、B暴露下, GST酶活性隨著濃度的增加而增加, 可能是為了免受重金屬的損傷而增加了GST的表達。所以不同價位的護膚品中存在的有毒有害物質對鯪的影響不同。護膚品A在暴露6 h后GST酶活性高于B、C護膚品28%左右, 說明中高價位的護膚品中存在的自由基以及有害的親電基團相對較少。

注: a是化妝品A, b是護膚品B, c是護膚品C; 不同大寫字母表示時間-酶活性差異顯著; 不同小寫字母表示濃度-酶活性差異顯著。

Figure 2 Effects of skin care product C on the activity of GST enzyme in

2.3 三種護膚品暴露對鯪GSH酶含量的影響

三種護膚品暴露對鯪GSH含量的影響如圖3所示。在時間-效應關系方面鯪GSH酶含量整體變化趨勢一致, 隨著時間增加呈現先增加后減少的趨勢。護膚品A暴露時間為6 h, 濃度為1.00 g·L–1時, 酶含量最大為0.28 U·mg–1, 顯著高于其他組酶含量(圖3a)。護膚品B暴露12 h, 濃度為0.75 g·L–1時, 酶活性被誘導, GSH酶含量達到最大, 為0.32 U·mg–1, 為對照組的3.2倍, 而后隨著時間的累積, 鯪機體平衡遭到破壞, GSH酶活性受到抑制, 酶含量顯著減少, 在暴露時間為48h時, 酶含量最低, 與對照組相比抑制了60%(圖3b)。護膚品C暴露12 h時, 暴露濃度為0.50 g·L–1時, 酶活性被誘導, GSH酶含量達到最大, 為0.23 U·mg–1(圖3c)。在濃度-效應方面, 護膚品A暴露鯪24 h, 鯪的GSH酶含量與濃度呈現正相關(<0.05)。護膚品B暴露鯪6 h和24 h時, 鯪的GSH酶含量與濃度呈現正相關(<0.05)。在護膚品C暴露下, 鯪的GSH酶含量在36 h、48 h呈現顯著負相關(<0.05), 在暴露36 h后, 隨著濃度的增加, 護膚品C暴露使得鯪酶活性受到抑制。

注: a是化妝品A, b是護膚品B, c是護膚品C; 不同大寫字母表示時間-酶活性差異顯著; 不同小寫字母表示濃度-酶活性差異顯著。

Figure 3 Effects of skin care products on the activity of GSH enzyme in

GSH是機體最重要的非酶性(水溶性)抗氧化物, 可作為GST和GPx的底物, 通過這兩種酶起解毒作用, 達到保護和恢復腎臟功能作用, 能清除機體內O2–、H2O2、LOOH 等脂質過氧化物[19,20]。因此 GSH 含量的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素。GSH含量增強是由于機體在對抗外界環境變化產生多余的活性氧[21]。在三種護膚品污染物作用下, 鯪GSH酶含量整體變化趨勢一致, 均隨著濃度的增加, 呈現先增加后減少的趨勢。說明一定劑量的護膚品暴露能夠增強鯪清除體內活性氧的能力, 隨著濃度的增加, 護膚品中攜帶的重金屬離子能夠增加細胞內活性氧自由基的生成, 導致機體抗氧化系統紊亂。護膚品暴露會影響鯪GSH酶活性, 隨著時間的變化, 甚至會抑制GSH酶的合成。三種護膚品暴露鯪12 h, GSH酶含量隨著濃度先增加后減少, 耿曉修等[22]也有相似的發現, 用較低劑量的Cr6+染毒, 草魚()肝臟GSH-Px的活力產生短暫的誘導效應, 后又隨Cr6+劑量的增加而下降。三種護膚品作比較, 護膚品C在暴露12 h后GSH酶達到最值, 而護膚品B、C在暴露6 h時, GSH酶含量達到最值, 說明護膚品C產生的影響小于護膚品A、B的影響。

2.4 三種護膚品暴露對鯪的毒性

至48 h暴露試驗結束, 對照組全部存活且未出現抑制現象。三種護膚品對鯪急性毒性試驗的48 h的 LC50值見表2。在48 h暴露條件下, 三種護膚品引起50% 鯪死亡的濃度分別為807 mg·L–1、973 mg·L–1、1147 mg·L–1。根據化學品魚類急性毒性分級試驗標準[23], 顯示護膚品 A、護膚品 B 和護膚品C的毒性分別為中毒物質, 中毒物質和低毒物質。

護膚品中很多成分進入水體中, 被水生生物富集于體內, 通過生物放大和生物累積作用在食物鏈間傳遞, 進而對更高營養級生物產生影響。不同價位的護膚品, 生產原料以及相應生產工藝流程也存在很大差異[1]。不同的油脂、乳化劑, 香料產生的效果, 對環境產生的影響也不一樣。由于護膚品與人們的生活密切相關, 日常暴露的同時, 隨洗漱廢水排放到市政中, 而護膚品中如人工麝香、雌激素等物質很難被污水處理廠去除, 而被排放到環境中, 因此, 其對水生生態系統的富集性毒性效應值得深入研究[1, 4, 6]。

表2 三種護膚品對鯪的毒性實驗

注:為死亡率概率單位, x為濃度的對數。

3 結論

不同護膚品暴露, 對鯪的SOD酶活性、GST酶活性、GSH酶含量產生不同程度的影響, 這些影響可以用作指示護膚品暴露的早期預警。暴露48h 鯪的LC50大小為C＞B＞A, 表明護膚品A的毒性大, 護膚品B次之, 護膚品C毒性最小, 說明中高價位的護膚品對鯪的影響較小。因此我們在選購護膚品的時候, 盡量選購中高價位的護膚品。

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Effects of exposure to three common brand skin care products on SOD, GST activity and GSH content of

FU Xiaojiao, HE Shixing, ZHENG Chao, YU Ling, LI Hanhan, YANG Zhanbiao, XU Xiaoxun, CHEN Zhang*

College of Environment, Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611100, China

To study the toxic effects of skin care products on, and provide scientific basis for the safe use and pollution control of skin care products, the activities of SOD, GSH and GST in the liver ofexposed to skin care products with different concentrations (0 g·L–1, 0.5 g·L–1, 0.75 g·L–1, 1.00 g·L–1) for 48h were measured after exposure for 0, 6 h, 12 h, 24 h, 36 h and 48 h. The mortality ofwas recorded, and the semi-lethal concentration (LC50) of three skin care products onwas also calculated. The results showed that the activity of SOD and GST enzyme reached the maximum when the exposure concentration of three kinds of skin care products was 1.00 g·L–1; the activity of three enzymes increased firstly and then decreased with the increase of time; GSH enzyme was inhibited when skin care products B and C were exposed for 48 hours; the LC50of skin care products A, B and C for 48 hours were 807 mg·L–1, 973 mg·L–1and 1147 mg·L–1, respectively. The high and medium price skin care products showed relatively less toxic to

skin care products;; exposure; enzyme activity; toxic effects

10.14108/j.cnki.1008-8873.2020.03.018

Q954.3

A

1008-8873(2020)03-132-07

2019-07-05;

2019-09-09

四川省青年科技基金(17QNJJ0160)

傅小嬌(1994—), 女, 碩士研究生, 主要從事生態毒理學研究, E-mail: fxjy516@126.com

程章, E-mail: cz@sicau.edu.cn

傅小嬌, 何世興, 鄭超, 等. 三種常見品牌護膚品暴露對鯪肝臟SOD和GST活性、GSH含量的影響[J]. 生態科學, 2020, 39(3): 132–138.

FU Xiaojiao, HE Shixing, ZHENG Chao, et al. Effects of exposure to three common brand skin care products on SOD, GST activity and GSH content of[J]. Ecological Science, 2020, 39(3): 132–138.